線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞 (MCAO) 模型
原理
腦血管疾病是人類發(fā)病率最高的疾病之一，模擬臨床疾病，制作較為可靠的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ惋@得尤為重要。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以制備全腦缺血模型和局灶性腦缺血模型。大腦中動(dòng)脈(MCA)是人群腦卒中的多發(fā)部位，MCA閉塞模型(MCAO)被普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，制作方法主要有以下幾種：開(kāi)顱結(jié)扎法(Tamura等采用頗下部開(kāi)顱，分離近端MCA,電凝或用手術(shù)絲線結(jié)扎MCA,造成腦梗死，是目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)MCAO)、光化學(xué)法(Watson等首次建立了光化學(xué)法誘導(dǎo)腦皮層梗死的動(dòng)物模型，即采用立體定位儀固定大鼠頭部，暴露顱骨，尾靜脈注射光敏材料熒光素Rose Bengal,用560nm波長(zhǎng)的特定光源照射局部頭顱，光線透過(guò)顱骨與血管內(nèi)的染料接觸，激發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，引起照射部位皮層血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性腦水腫而導(dǎo)致腦梗死）、栓塞法(Kudo等采用<100μ,m的同源血凝塊栓子懸液，注入頸總動(dòng)脈CCA,在頸外動(dòng)脈ECA的頸內(nèi)動(dòng)脈ICA開(kāi)口處置一可逆性插管，栓子則由ICA進(jìn)入MCA,導(dǎo)致同側(cè)大腦皮層、海馬、深層灰質(zhì)結(jié)構(gòu)的梗死；也有人用碳素顆粒、花生四烯酸鈉作為栓塞劑制成腦梗死模型），以及我們要詳細(xì)介紹的線栓法。線栓法用于制作局灶性腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究，其基本原理是用線栓阻閉大腦中動(dòng)脈起始部，造成大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血，從而使大鼠發(fā)生局灶性腦缺血。此方法的特點(diǎn)是穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、損傷小、梗死部位確切和成功率高。
材料與儀器
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
1%戊巴比妥鈉
手術(shù)臺(tái) 加熱板 多功能生理監(jiān)測(cè)儀 尼龍線 酒精燈 硅膠 手術(shù)刀 血管鉗 攝子 手術(shù)線 皮針
步驟
1.制備線栓，選擇3-0的尼龍線27mm,頭端用酒精燈加熱成直徑為0.33mm的半球形，并用硅膠脂涂抹。
2.250-300g大鼠，2%戊巴比妥鈉每千克體重40-60mg腹腔注射麻醉。
3.動(dòng)物麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，用肛溫探頭測(cè)定大鼠肛溫，取肩腫連線以上正中切口，用血管鉗垂直鈍性分離甲狀腺連接部，暴露頸部肌群。
4.鈍性分離由二腹肌，胸鎖乳突肌和肩脾舌骨肌組成的肌間隙，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，再逐步暴露頸總動(dòng)脈分叉，頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。
5.然后用3-0的手術(shù)線結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和頸總動(dòng)脈近心端，并用手術(shù)線緊拉頸內(nèi)動(dòng)脈使與頸總動(dòng)脈成一條直線。
6.通過(guò)Longa評(píng)分法或者Garcia評(píng)分法，以及腦梗死容積的測(cè)定，來(lái)篩選和判斷模型制作是否成功。
Longa評(píng)分法： 6級(jí)評(píng)分法
①0級(jí)無(wú)功能障礙；②1級(jí)不能伸展左側(cè)前肢；③2級(jí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；④3級(jí)向左側(cè)傾倒；⑤4級(jí)無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)抑制；⑥5級(jí)死亡。初步評(píng)定模型的成功與否，將評(píng)分在1-3級(jí)的動(dòng)物納入下一步實(shí)驗(yàn)，其余動(dòng)物予以排除。
Garcia評(píng)分法：
Garcia評(píng)分法最低為3分，最高為18分，得分越高表明動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)狀況越好。其中前4項(xiàng)評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能，后2項(xiàng)評(píng)價(jià)動(dòng)物的感覺(jué)功能。3-7分為重度神經(jīng)功能障礙，8-12分為中度神經(jīng)功能障礙，13-16分為輕度神經(jīng)功能障礙（表4-3片將評(píng)分在7-13分的動(dòng)物納入下一步實(shí)驗(yàn)，其余動(dòng)物予以排除。
7.腦梗死容積的測(cè)定：
用TTC染色來(lái)確定腦梗死容積。
(1)斷頭處死動(dòng)物，迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10min。
(2)于腦槽中取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，迅速放入2% 2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)溶液(37℃)中染色30min,然后用4%多聚甲酸固定。
(3)24h后用數(shù)碼相機(jī)拍照，輸入計(jì)算機(jī)，用圖像處理軟件(ADOBE,PHOTOSHOP)計(jì)算梗死面積，粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū)。
(4)為減少腦缺血半球水腫對(duì)結(jié)果帶來(lái)的影響，梗死容積采用損傷對(duì)側(cè)正常組織容積減去同側(cè)正常組織容積的辦法來(lái)計(jì)算，結(jié)果用梗死容積百分比表示。梗死容積百分比＝（對(duì)側(cè)正常組織容積－同側(cè)正常組織的容積）／對(duì)側(cè)正常組織容積X100%。
注意事項(xiàng)
1.在尼龍線的選擇方面，可供選擇的有3-0和4-0等規(guī)格，動(dòng)物體重在250-300g時(shí)，選擇3-0的尼龍線。
2.小鼠程序同大鼠，所選動(dòng)物體重范圍20-25g,線栓用6-0,線栓頭0.1mm左右，深度9mm左右。
3以下二條，有一條滿足應(yīng)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剔除：
① 手術(shù)過(guò)程中出血過(guò)多，3h未蘇醒者應(yīng)剔除；②Longa評(píng)分法是0分，或Garcia評(píng)分在0-6，14-18分的大鼠應(yīng)當(dāng)剔除；③顱底出血的動(dòng)物也應(yīng)剔除（判斷顱底出血的方法是將大鼠大腦取出后觀察大腦中動(dòng)脈起始部有沒(méi)有出血塊）。
常見(jiàn)問(wèn)題
1動(dòng)物麻醉對(duì)手術(shù)后死亡率有很大的影響，麻醉藥最好現(xiàn)用現(xiàn)配，未用完的麻醉藥最好4℃保存。
2.手術(shù)過(guò)程中分離血管時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免對(duì)迷走神經(jīng)造成損傷。牽拉血管時(shí)應(yīng)將頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈擺成一條直線，這樣可以減少放線栓時(shí)插入翼鄂動(dòng)脈的概率。
3.在插入線栓時(shí)，感覺(jué)到有阻力時(shí)用鑷子尖部輕輕推一兩下，但不能用力過(guò)大。這樣既可以保證模型的成功率也可以減少顱腔內(nèi)出血的可能。
4.手術(shù)完成后結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)一定要注意扎緊，以免線栓拖出。
