原理
用 1 mm 直徑的玻璃珠，通過與硅烷成分的反應來實現玻璃表面的活化，從而引入氨基。通過對硝基苯酰氯化物的進一步修飾，硝基被加到氨基上，氨基和亞硝基一起被轉變為陽離子重鹽，酶通過酪氨酰殘基被連接（圖 1）。
圖 1 硅烷化玻璃表面和共價固定化酶。Ⅰ 硅烷化玻璃表面的 Si-OH 基團用 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（3-aminopropyl-triethoxysilane）；Ⅱ 通過 p-硝基苯酰氯化物衍生氨末端；Ⅲ 用連二亞硫酸鈉減少硝基；Ⅳ 用亞硝酸形成陽離子重鹽；Ⅴ 酶通過酪胺酰殘基被連接
材料與儀器
酶溶液
3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 對硝基苯酰氯化物 二氯甲醇 三乙胺 亞硝酸鈉 濃鹽酸 鹽酸 連二亞硫酸鈉 硝酸 磷酸鉀
玻璃珠子
步驟
1. 玻璃珠的活性
玻璃珠（10 g）在 40 ml 5％ 硝酸中 80～90℃ 加熱 1 h。其后珠子用蒸餾水洗三次，并被轉移到 PE 容器中避免硅烷化和酶固定到長頸瓶的壁上。添加水（10 ml）和 3 g 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷，pH 先用濃 HCl 調節，最終用 2 mol/L 的 HCl 將 pH 調到 3～4，用 pH 指示紙來檢測（pH 電極會被損壞）。反應的混合物在 65℃ 中孵化 12 h，之后珠子在吸濾器（瓷器，無玻璃粉）上用水沖洗 5 次，用丙酮沖洗 3 次（每次 20 ml）。最后珠子在 55℃ 干燥 20 min。
2. 重氮化作用
后面的程序必須用玻璃容器。為了玻璃珠子的活化，添加 25 ml 二氯甲醇、1.5 g 三乙胺和 5 g 對硝基苯酰氯化物，回流煮沸 4 h，要避免潮濕。珠子用 10 ml 二氯甲醇沖洗 3 次，在 55℃ 短暫干燥。之后為了自由氨基的重氮化作用，這些珠子被轉移到含 1 g NaNO2 的 100 ml 2 mol/L HCl 溶液中，在室溫靜置 20 min。用水劇烈地沖洗珠子后，將珠子在 40 ml 含 2 g 連二亞硫酸鈉的 40 ml 水溶液中回流 lh。芳基胺珠子形成，用 20 ml 的水沖洗三次，轉移到圓底的長頸瓶中，添加 88 ml 的 2 mol/L HCl。長頸瓶被安裝在旋轉的脫水器上，在冰浴中旋轉，保證在 0℃ 冰浴。在 20 min 內，將 1.12 g 的 NaNO2 慢慢地添加一部分，在其間長頸瓶在非真空狀態下一直轉動，在添加了最后一部分之后，長頸瓶必須用一個弱的噴水式真空推進器旋轉 10 min（大約 20 mbar），用于排出含氮氣體。產生的重氮基玻璃用 20 ml 的冰水沖洗 3 次，之后必須馬上用于固定。在用于固定之前的這段時間必須保存于 4℃。
3. 酶的固定
酶溶液（10 mg 溶于 10 ml 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸鉀）被添加到玻璃珠子中，長頸瓶在 4℃緩慢旋轉過夜（12～16 h）。其后玻璃珠子用 5 ml 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸鉀緩沖液沖洗 3 次。浮在表面的緩沖溶液被收集，用來決定未被固定的蛋白質和酶的活性，用這種方法來評估固定的效率
注意事項
在操作中一定要注意有毒試劑和侵蝕性試劑。避免使用磁力攪拌器，因為它會損壞玻璃表面的修飾。
