組織薄片膜片鉗全細胞記錄實驗
原理
通過全細胞膜片鉗技術來檢測組織薄片（脊髓片或腦片）上神經元的突觸后電位、突觸后電流及該突觸后電位或電流的可塑性改變等現象。組織薄片膜片鉗技術與分散細胞膜片鉗技術相比，具有的優點是組織薄片中的細胞更接近在體的原始環境，很好地保持了神經元之間的突觸聯系。
材料與儀器
神經細胞
孵育細胞外液 記錄細胞外液 細胞內液
冰袋2個 碎冰若干 維納斯剪 剪刀 攝子 游絲攝2把 維納斯剪 剪刀 攝子 游絲攝2把
步驟
1腦片的制備
(1)動物麻醉后斷頭并取出腦組織放入冰凍的孵育細胞外液中，該孵育細胞外液預先用95%02和5%CO2飽和，冰凍的程度以冰水混合液為好。
(2)將腦組織塊粘在切片臺上，用振動切片機切取200-300μm厚的腦片。
(3)將切下來的腦片移至孵育槽中進行孵育，持續通以95% C02和5%C02的混合氣，1h后開始進行記錄。
2.脊髓薄片的制備
(1)動物腹腔注射烏拉坦麻醉，劑量為1.2-1.5mg/kg。
(2)沿中線切開背部皮膚和肌肉，行椎板切除術，暴露脊髓。
(3)在胸段橫斷脊髓，提起殘端，用維納斯剪逐次剪斷髓旁背根及腹根，使目標節段背根保留3-5mm以上長度，取出脊髓腰膨大脊髓。
(4)在顯微鏡下進行撕膜等操作，保留一側脊神經L4或L5背根，撕去其他所有前根及背根，并仔細除去脊髓表面硬脊膜和蛛網膜。
(5)將帶有L4或L5背根的脊髓放置于帶有90°凹槽的瓊脂塊上。
(6)將瓊脂塊粘于切片槽上，注意使脊髓尾側向上。將冰水混合孵育細胞外液倒入切片槽，保證脊髓直立，目的節段背根懸浮在脊髓一側。
(7)Vibrotom震動切片機速度調至1-2,振幅調至7-8,在目的節段背根根部上方及下方進刀。在上方進刀時用攝子輕壓背根，使之處于刀片下方；在下方進刀時，用鑷子輕提背根未端，使刀片從其根部下方通過，切片厚度保持在350-450μm。
(8)將切片中攝子夾持過的背根未段剪斷。
(9)用吸管將切好的脊髓薄片置于通有95%02和5%CO2的混合氣的孵育細胞外液中，孵育1h后，轉入記錄細胞外液中進行膜片鉗實驗。
3.組織薄片的觀察和記錄：
(1)記錄槽中灌流液的持續灌流可能會引起組織薄片的飄動，因此為了保證記錄的穩定，需要將組織薄片固定。通常將一個鉛金絲制成一個開口的矩形框，上面間隔一定距離用502膠將尼龍絲繃直粘牢。將這樣一個鉛金壓片網壓在組織薄片上可以很好地將薄片固定。
(2)在紅外可視條件下，選擇表面光滑、輪廓清晰的神經元進行封接，進行全細胞記錄（圖3-10)。
(3)以脊髓薄片上的記錄為例，顯示不同突觸后電流形式的記錄方法。刺激背根誘發的興奮性突觸后電流(evokedEPSC,簡稱eEPSC)。在鉗制電壓為-70mV,記錄液中加入Strychnin(甘氨酸受體阻斷劑）和Bicuculin(GAB凡受體阻斷劑）以及AP-5(NMDA受體阻斷劑）的條件下，通過吸引電極給予后根施加0.2Hz的方波刺激(DurationI00μs),直到記錄到誘發的eEPSC。根據刺激強度閾值和傳導速度判斷eEPSC是由哪類初級傳入纖維介導的，因脊髓背角淺層主要接受傷害性信息的傳入，所以所記錄到的eEPSC主要是由Aδ或C類纖維介導的。A&纖維誘發的eEPSC的刺激強度闕值一般為10-60μA,傳遞速度為2-13m/s;而C纖維誘發的eEPSC的刺激強度闕值一般為160-530μA,傳遞速度一般小于0.8m/s。根據高頻刺激(20Hz或2Hz)是否引起eEPSC出現誘發失敗和潛伏期是否一致來判斷eEPSC是經初級傳人纖維單突觸傳遞介導的還是經脊髓背角中間神經元中介的多突觸傳遞介導的（圖3-11片對于Ao纖維誘發的eEPSC,我們通常采用20Hz刺激連續刺激20次，如果每次eEPSC都能成功誘發（即不出現誘發失敗現象）及潛伏期保持一致的話，我們認為該eEPSC為單突觸介導，否則為多突觸介導；對于C纖維誘發的eEPSC,我們通常采用2Hz刺激連續刺激20次，如果每次eEPSC都能成功誘發（即不出現誘發失敗現象）及潛伏期保持一致的話，我們認為該eEPSC為單突觸介導，否則為多突觸介導。自發興奮性突觸后電流(sEPSC)和微小興奮性突觸后電流(mEPSC)。在鉗制電壓為-70mV,記錄液中加入Strychnin(甘氨酸受體阻斷劑）和Bicuculin(GAB凡受體阻斷劑）以及AP-5(NMDA受體阻斷劑）的條件下，不施加任何外界刺激在脊髓背角神經元上記錄到的自發產生的興奮性突觸后電流即為sEPSC。進一步加入TTX阻斷細胞之間的動作電位傳遞之后，即可記錄到微小興奮性突觸后電流（即mEPSC)。抑制性突觸后電流(IPSC)。在鉗制電壓為-70mV,記錄液中加入CNQX(AMPA受體阻斷劑）和AP-5(NMDA受體阻斷劑）的條件下便可記錄到抑制性突觸后電流(IPSC)。IPSC包括GAB凡受體介導的IPSC和甘氨酸受體介導的IPSC,前者可由記錄外液中加入Strychnin所分離，后者可由記錄外液中加入Bicuculin所分離。
注意事項
1.注意切片時整個系統溫度應保持在O℃左右，即要用碎冰對刀片及切片槽周圍進行降溫。
2.選擇健康的細胞進行鉗制是保證實驗高效、結果準確的一個關鍵因素。
3.脊髓撕膜時注意不要牽拉背根，可用剪刀將非目的節段背根剪掉。
常見問題
1整個實驗過程中組織薄片的制備非常關鍵，因為切片的質量直接決定細胞狀態的好壞和實驗的成功與否。尤其是在帶后根脊髓薄片的制作過程中，一定要注意動作輕柔、切莫大刀闊斧，尤其要注意對后根及后根進入區的保護，因為此處非常脆弱，一旦遭到損傷，即使神經元狀態再好也記錄不出刺激后根誘發的反應。
2.溶液配制：
1.孵育細胞外液，含NaCl 95mM,KCl 1.8mM,KH2P04 1.2mM,CaCl2 0.5mM,MgS04 7mM,NaHC03 26mM,glucose 15mM,sucrose 50mM,通以含95%02與5%CO,混合氣體、pH調至7.4,滲透壓調至310-320mOsm。
2.記錄細胞外液，含NaCl 127mM,KCI 1.8mM,KH2P04 I.2mM,CaC12 2.4mM,MgS04 1.3mM,NaHC03 26mM,glucose 15mM,sucrose 0mM,通以含95%02與5%C02混合氣體，pH調至7.4,滲透壓調至310-320m0sm。
3.細胞內液，含potassium gluconate 120mM,KCl 20mM,MgCl2 2mM,Na2ATP 2mM,NaGTP 0.5mM,HEPES 20mM,EGTA 0.5mM,用KOH將pH值調至7.28,將滲透壓調至 300m0sm.,
4.將孵育細胞外液首先通混合氣(95%02,5%C02)半小時至氧飽和狀態，取出200ml置冰箱冰凍至冰水混合狀態，其余液體繼續保持混合氣通灌。
