細胞內鈣成像實驗
原理
鈣離子是一種重要的細胞內第二信使，參與許多重要的細胞生理活動和病理過程，因此監測細胞內鈣離子水平的變化對了解細胞的活動狀態非常重要。細胞內鈣成像技術是通過向細胞內載入鈣指示劑，利用鈣指示劑與鈣結合后發生熒光強度或波譜性質改變的特征來監測胞內鈣離子濃度的變化。目前常用的鈣指示劑主要是化學熒光指示劑，如Fura-2,Fluo-3等。其中Fura-2為比值型指示劑，它在鈣游離和鈣結合狀態下發生光譜性質的改變，如在鈣結合狀態下它的激發波峰由363nm變為335nm,而發射波峰無明顯變化，因此通常采用雙波長(340nm和380nm)兩次相繼激發，激發后所得到的發射光強之比即為鈣信號的相對值（圖3-12)。因Fura-2的數據結果采取比值的方式，因此不受實驗設備、指示劑的負載濃度、細胞類型和實驗者個體操作等的限制，同時還可以消除細胞的厚薄變化、指示劑在胞內的重新分布變化等因素的影響，真實地反映細胞內鈣們號的變化。因此Fura-2是目前應用最為廣泛的化學熒光鈣指示劑。
材料與儀器
神經組織
Fura-2AM PluronicacidF-127(20%) Ringer液或人工腦脊液(ACSF) 1M的HEPES溶液配制1MHEPES儲備液
熒光顯微鏡 單色光源系統 高速高靈敏度數字冷CCD 顯微影像軟件 其他Fura-2專用濾光片組
步驟
1.培養細胞鈣成像：
(1)標本制備大鼠或小鼠頸椎脫臼致死或缺氧致死，取材、分離打散細胞然后對其進行培養3-7d。
(2)Fura-2AM溶液制備將Fura-2AM首先溶解在DMSO中制備成1OmM的儲備液，然后分裝置于-20℃。在當日實驗時將1OmM的Fura-2AM與助擴散劑PluronicacidF-127(20%)溶解在Ringer液中，具體配方如表3-l。
(3)iura-2AM負載細胞將上述配置好的Fura-2AM溶液加入培養細胞(24孔板）中室溫孵育30min,之后吸出Fura-2AM溶液加入正常Ringer液洗脫30min,待用。整個過程中24孔板外用錫箔紙包被注意避光。
(4)培養細胞鈣成像將Fura-2負載后的細胞置入熒光顯微鏡載物臺上，相繼應用340nm和380nm的激發波長各曝光30s,曝光頻率為1Hz,計算F340/F380比值代表相對鈣水平。灌流給予某種可以誘發胞內鈣升高的激動劑時，便可以觀察到熒光強度的改變，具體表現為340nm激發波長下的熒光強度增加，而380nm激發波長下的熒光強度減弱，因此F340/F380比值增大?.
2.急性組織薄片鈣成像；
(I)標本制備大鼠或小鼠腹腔注射烏拉坦麻醉后，取材，在振動切片機上切取350-450μm厚的組織薄片（脊髓片或腦片），置于通有95%02和5%C02的混合氣的人工腦脊液中孵育。
(2)Fura-2AM(1OμM)溶液制備同上，將Fura-2AM首先溶解在DMSO中制備成1OmM的儲備液，然后分裝置于-20℃。在當日實驗時將1OmM的Fura-2AM與助擴散劑PluronicacidF-127(20%)溶解在人工腦脊液(ACSF)中，具體配方如表3-2。
(3)Fura-2AM負載細胞將組織薄片（脊髓片或腦片）放置在上述配制好的Fura-2溶液中孵育45min,負載完成后將其放置在無Fura-2的正常人工腦脊液中洗脫30min,然后開始進行鈣測定。注意整個過程中持續通95%02和5%CO2的混合氣體，并且在避光下進行。
(4)組織薄片鈣成像將Fura-2負載后的組織薄片（脊髓片或腦片）置人熒光顯微鏡載物臺上，相繼應用340nm和380nm的激發波長各曝光30ms,曝光頻率為1Hz,計算F340/F380比值代表相對鈣水平。如彩頁圖3-14所示，電刺激背根后誘發脊髓背角淺層區域細胞的鈣水平顯著升高，具體表現為340nm激發波長下的熒光強度增加，而380nm激發波長下的熒光強度減弱，因此F340/F380比值增大。
注意事項
1.為避免或減少熒光淬滅，所有操作程序需在避光下進行。
2.因Fura-2AM在脫脂的過程中會產酸，因此需要在溶液中加入HEPES以維持pH值的穩定。否則，過酸會導致細胞死亡。
常見問題
1在Fura-2AM負載前觀察細胞或組織薄片的狀態，其狀態的好壞決定了Fura-2AM負載的效率。溫度對Fura-2AM負載的效率沒有絕對影響，室溫或33℃-37℃下負載均可。Fura-2AM負載細胞時間控制在30-60min為宜。在配置Fura-2AM溶液的過程中加入HEPES尤其重要，因為Fura-2AM在穿過細胞膜被酯酶剪切形成Fura-2的過程中會產酸，因此需要在溶液中加入HEPES以維持pH值的穩定。否則，過酸會導致細胞死亡。在應用340nm和380nm激發波長相繼激發熒光時，曝光時間一般為10-50ms,曝光時間過長容易引起熒光淬滅。在鈣指示劑負載脊髓薄片或腦片組織過程中，最好持續通有混合氣體，以保證良好的細胞狀態。
2除了上述通過孵育的方式將酯質化的鈣指示劑Fura-2負載入細胞內進行鈣測定外，還可以應用微電極將鈣指示劑直接載入細胞內。這一方法是與電生理膜片鉗技術相結合的鈣測定所普遍采用的負載方法。將指示劑溶解在電極內液中，在對細胞形成全細胞記錄后，指示劑通過低阻抗電極尖端被動地擴散至細胞內。利用這種方法負載指示劑，可以針對任何一種指示劑形式。指示劑負載入細胞后，鈣測定程序同上所述。
