蛋白質(zhì)與溴化氰活化的瓊脂糖結(jié)合實驗

原理

材料與儀器

蛋白質(zhì)
瓊脂糖 4B NaOH 溴化氰 NaHCO3 氨基乙酸 乙酸鈉-乙酸 磷酸二氫鉀
天平 燒瓶 螺旋攪拌器 布氏漏斗

步驟

實驗所需「試劑」具體見「其他」

1. 制備 CNBr-活化的瓊脂糖 4B

以下步驟必須在通風櫥中小心進行。用 3 mol/L NaOH 將瓊脂糖 4B 懸液調(diào)整為 pH 11.2，用 pH 計進行檢測。在天平上放置一燒瓶，重量歸零，將 0.67 g 固體 CNBr 溶解在少量水中，小心塞住燒瓶口。邊攪拌（KPG 或螺旋攪拌器，不要用磁力攪拌器）邊將 CNBr 溶液小心加入凝膠懸液中，持續(xù)保持 pH 11.2，可用 3 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)。當 pH 6 min 保持不變時，立刻用 1 L 水通過布氏漏斗或玻璃料沖洗凝膠。

2. 連接蛋白

沖洗 CNBr-活化的瓊脂糖懸液（20 ml）并轉(zhuǎn)移到相同體積的 0.1 mol/L NaHCO3 溶液，pH 8.2。加入 0.5 mol/L NaCl 和 0.2 g 蛋白質(zhì)。懸液室溫振蕩 3 h 或 4℃ 過夜。測定上清中的蛋白質(zhì)含量從而確定被固定的蛋白質(zhì)量。加入 5 ml 1 mol/L 氨基乙酸以封閉剩余活性基團。首先用 0.1 mol/L pH 4.0 乙酸鈉-乙酸沖洗凝膠，再用 0.1 mol/L pH 7.6 的磷酸二氫鉀沖洗。為了儲存凝膠，最后還需加入 NaN3，使其終濃度達到 0.1 mol/L。

常見問題

試劑：

瓊脂糖 4B，懸液，6.6 g 溶于 20 ml H2O

3 mol/L NaOH（Mr＝40.0；12 g 溶于 100 ml 水中）

溴化氰（CNBr，Mr＝105.9）

0.1 mol/L NaHCO3（Mr＝84.0；0.84 g/L 100 ml）pH 8.2，含 0.5 mol/L NaCl（Mr＝58.4；2.92 g/100 ml）

1 mol/L 氨基乙酸（Mr＝75.1；1.5 溶于 20 ml H2O）

0.1 mol/L 乙酸鈉-乙酸，pH 4.0

0.1 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 7.6