分光光度計(jì)法測(cè)定還原反應(yīng)

原理

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，是糖代謝酵解途徑的關(guān)鍵酶之一。LDH可溶于水或稀鹽溶液。組織中LDH含量測(cè)定方法很多，其中紫外分光光度法更為簡單、快速。鑒于NADH，NAD+在340nm及260nm處有各自的最大吸收峰，因此以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類都可通過340nm光吸收值的改變，定量測(cè)定酶的含量。

材料與儀器

組織樣品
磷酸鉀 NADH 丙酮酸
分光光度計(jì)

步驟

一、試劑：

0.1 mol/l 磷酸鉀 pH 7.0

0.01 mol/l NADH（71 mg 溶于10 ml H2O 中）

0.1mol/l 丙酮酸（丙酮酸鈉，Mr＝110；110 mg溶于10 ml H2O 中）。

LDH 原料溶液（從豬心臟提取，例如 10 mg/ml，用 0.1 mol/l 磷酸鉀 pH 7.0 稀釋至 1 IU/ml）

二、LDH活力測(cè)定

1. 取1只比色杯中加入0.1 m mol/L pH7.5 磷酸氫二鉀緩沖液3ml，置于紫外分光光度計(jì)中，在340nm處將光吸收調(diào)節(jié)至零。

2. 取1只比色杯，依次加入丙酮酸鈉溶液2.9ml，NADH溶液0.1ml，加蓋搖勻后，加入經(jīng)稀釋的酶液10μl，加蓋搖勻后，在A340nm，連續(xù)測(cè)定3min，以A對(duì)時(shí)間作圖，取反應(yīng)最初線性部分，計(jì)算A340nm/min減少值。

三、數(shù)據(jù)處理

計(jì)算每毫升組織提取液中LDH活力單位。

注意事項(xiàng)

加入酶液的稀釋度（或加入量）應(yīng)控制在A340nm/min減少值在0.1-0.2之間。