半乳糖苷酶活性的整體封片染色和免疫組化檢測

原理

材料與儀器

小鼠或雞的整個胚胎、組織或外植體
磷酸鹽緩沖液（PBS) 冰冷 β-半乳糖苷酶固定劑 β-半乳糖苷酶洗滌緩沖液 β-半乳糖苷酶染色液
5 mL或10 mL的聚苯乙烯或聚丙烯帽蓋的試管或1.5?2 mL的離心管 轉動平臺 染色用密閉箱 附有蓋玻片的下陷載玻片或箱式載玻片 纖光照明的解剖顯微鏡 顯微照相儀

步驟

1)在冰冷的PBS里解剖胚胎或組織。置β-半乳糖苷酶固定劑，室溫至合適的時間。以下是固定小鼠胚胎和組織的指導：外植體和E 6.5到E 7.5胚胎5?10 min； E 8到E 9.5胚胎或尾巴切面 15?30 min； E 10 到 E 12.5 胚胎 30 min?1.5 h; E 13 到 E 14.5 胚胎 2 h; E 15.5 或更大的組織則需要解剖出來或切一半，然后固定2 h。新生幼鼠或更大的小鼠的灌注需要在解剖特定組織染色之前進行。

2) 用β-半乳糖苷酶洗滌緩沖液室溫洗滌3次，每次15 min (針對小胚胎或尾巴切面）， 或每次30 min (針對Ell胚胎和大組織），頭尾相接地輕柔轉動。

3) 將組織置于β-半乳糖苷酶染色液中（室溫，30℃或37℃取決于β-半乳糖苷酶表達豐度），在一5 mL或10 mL的帽蓋的試管或1. 5?2 mL的離心管中孵育，以防止蒸發。可以用肉眼或解剖顯微鏡調節染色程度。

4) 得到預期的信號背景比之后（1?48 h)，在PBS中洗滌組織3次，每次30 min。

5) 通過解剖鏡觀察和拍攝樣本染色的組織，使用低功率的物鏡和來自側面和頂端的光纖照明。為了得到最好的結果，將組織放置在附有蓋玻片的下陷載玻片或箱式載玻片，用足夠的PBS覆蓋組織。

注意事項

戊二醛、甲醛、脫氧膽酸鈉、亞鐵氰化鉀和高鐵氰化物、二甲基甲酰胺、Histoclear、苯 甲酸芐酯、苯甲醇和 Perniount 是危險物質。它們的操作和處理均需按照制造商的指導。

常見問題

分離小鼠胚胎和雞的胚、組織或外植體，部分固定以保持β-半乳糖苷酶的活性，徹底洗滌去除固定劑，如果有必要可厚切片，在顯色底物存在的情況下染色。 接下來，染色組織整體封片照相，樣本包埋，切片，顯示報道基因的細胞和組織特異性表達。強烈推薦做預備試驗，這樣可以估計和標準化特定試驗和組織的最優化條件