乙醇脫氫酶的測定實驗還原反應測定
原理
ADH 反應:
乙醛 + NADPH + H+ ? 乙醇 + NAD+
此反應是可逆的,并且可以從兩個位點檢測出來,平衡常數是 8×1012 mol/L。乙醇的生成是人們希望看到的,由此可以更為簡單地檢測這個方向的反應進程。但是也有極為不利的因素,即乙醛的毒性以及此反應速度過快。
材料與儀器
乙醇脫氫酶
磷酸鉀 BSA 溶液 NADH 乙醛
分光光度計
步驟
實驗所需「試劑」具體見「其他」
0.98 ml 的實驗混合物
0.02 ml ADH(0.02 IU)
25 ℃ 時,于 340 nm 處吸收值降低。為了方便量化,經常使用 NADH 的吸收系數 ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
常見問題
試劑:
0.1 mol/L 磷酸鉀,pH 7.5
0.1 g BSA 溶于 100 ml 0.1 mol/L 磷酸鉀溶液中,pH 7.5(BSA 溶液)
0.01 mol/L NADH(71 mg 溶于 10 ml H2O)
0.5 mol/L 乙醛,2.2 g(2.82 ml)溶于 100 ml H2O
用 BSA 溶液稀釋 ADH:按照其活性,商業購買的酶需要被稀釋,例如 0.02 IU 的 ADH 每分鐘轉化 0.02 mol NADH,相當于吸收值變化 0.126,這是一個對反應來說很方便的數值。對于 400 IU/mg 購買的 ADH,也許需要將 10 mg/ml(4000 IU/ml)的原料溶液溶于 pH 7.5、0.1 mol/L 的磷酸鉀中。然后,稀釋溶液 4000 倍(2.5 ul 溶于 10 ml BSA 溶液中),使其最終為 1 IU/ml。取出 20 ul 做酶的測定實驗。