酵母菌基因組轉(zhuǎn)座子的誘變實(shí)驗(yàn)
材料與儀器
誘變轉(zhuǎn)座子基因組文庫(kù)質(zhì)粒DNA
10×TE緩沖液 pH 8.0 無(wú)菌 E. coli tets kans (如 DH5c×) 14 cm的LB培養(yǎng)基平板 培養(yǎng)基中加入3 mg mL的四環(huán)素和40μg mL的卡那霉素 LB培養(yǎng)基 丙三醇 無(wú)菌NotⅠ 非限制性內(nèi)切核酸酶及緩沖液 Ura3_酵母菌培養(yǎng) 一步（One~step)緩沖液 10 mg mL的變性的鮭精DNA CM缺失成分培養(yǎng)基平板和無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基
臨床用臺(tái)式離心機(jī)、45℃水浴或孵育箱、無(wú)菌牙簽、3MM無(wú)菌濾紙（Whatman)
步驟
1)溶液干了之后，從轉(zhuǎn)座子誘變基因組文庫(kù)的個(gè)體庫(kù)里分配質(zhì)粒DNA (每個(gè)庫(kù)約為1μg DNA)。短時(shí)間離心每個(gè)干的樣品，用pH 8. 0的TE緩沖液以合適的容積重懸每 個(gè)庫(kù)的DNA (如每個(gè)庫(kù)10體積)。文庫(kù)DNA的每個(gè)庫(kù)都被單獨(dú)誘變；所以分開(kāi) 處理每個(gè)庫(kù)的DNA以保證得到獨(dú)立插入等位基因。
2)從每個(gè)庫(kù)中取適當(dāng)?shù)腄NA的量，以標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化步驟轉(zhuǎn)入對(duì)任何四環(huán)素 (tets)和卡那霉素（kans)敏感的大腸桿菌菌株內(nèi)。
3)在加入3 pg/mL的四環(huán)素和40μg /mL的卡那霉素的直徑為14 cm的LB培養(yǎng)基平板上挑選轉(zhuǎn)化株。
4)通過(guò)在每個(gè)平板表面加6 mL的LB培養(yǎng)液洗脫轉(zhuǎn)化株克隆并刮取細(xì)胞使成為均勻的 懸液。保存一部分懸液；-70℃下于15%的丙三醇里保存。
5)用100 mL含3μg /mL四環(huán)素和40μg /mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基稀釋1 mL這種洗脫 液，進(jìn)行培養(yǎng)使細(xì)胞密度幾乎達(dá)到飽和。在通風(fēng)的條件下，37℃孵育2?3h。
6)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的小量制備或大量制備來(lái)分離質(zhì)粒DNA。
7)用非限制性內(nèi)切核酸酶NotⅠ消化來(lái)自每個(gè)庫(kù)的小量（典型的量至少為 1μg)的質(zhì)粒DNA (在步驟6中獲得）。接下來(lái)為了確保mTn誘變的酵母菌DNA 從pHSS6載體上釋放，取一部分反應(yīng)混合物，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行分析。剩余的反應(yīng)混合物于4℃保存以備后用（見(jiàn)步驟10)。在電泳凝膠上可以看到一條清楚的2. 1kb的pHSS6條帶和一條寬的8kb的mTn誘變的酵母菌基因組DNA條帶。
8)取10 mL要用作研究的Um3-酵母菌株培液進(jìn)行培養(yǎng)，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（密度為1O7細(xì)胞/mL或OD600約為1)保持適合的選擇，以備應(yīng)用。
9)臨床用臺(tái)式離心機(jī)于室溫下1100 g將細(xì)胞離心5 min,用5體積的一步緩沖液洗滌沉淀物一次。
10)在1 mL的一步緩沖液里加入1 mg變性的鮭精DNA并重懸細(xì)胞，在裝有0. 1?1μL的從步驟7中得到的用非限制性內(nèi)切核酸酶I消化的質(zhì)粒DNA的微型離心管里加入100μL 的重懸液，在渦旋振蕩器上振蕩使其充分混合。
11)45°C孵育混合物30 min。
12)室溫下微型離心機(jī)上以最大速度將細(xì)胞離心5 s，隨后在400μL的CM (-Ura)缺 失成分培養(yǎng)基中重懸沉淀物。取200μL 重懸液加到CM (-Ura)缺失成分培養(yǎng)基平板上。30℃孵育3?4天。
13)為了最大限度檢測(cè)出在低水平表達(dá)的hcZ-融合產(chǎn)物，將轉(zhuǎn)化克隆以每平板達(dá)到100個(gè)克隆的密度用無(wú)菌牙簽轉(zhuǎn)移到Y(jié)PAD培養(yǎng)基平板上。
14)在CM(-Ura)缺失成分培養(yǎng)基平板上放置一個(gè)3 MM無(wú)菌濾紙圓片；在許多要用 的培養(yǎng)基平板上重復(fù)此操作。將轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞復(fù)制到濾紙覆蓋的平板上，以易于鑒定 YPAD培養(yǎng)基平板上相應(yīng)的克隆（步驟13)，30℃孵育過(guò)夜。
其他生長(zhǎng)條件（如在孢子形成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)）可以根據(jù)需要取代上述條件。
15)過(guò)夜生長(zhǎng)后，從平板上拿起濾紙并放在一個(gè)9 cm的玻璃皿的蓋子里。把這個(gè)蓋子 放進(jìn)盛有氯仿的一個(gè)15 cm的閉合的玻璃皿里。孵育10?30 min溶解菌株。
16)將濾紙克隆面向上放在很薄的λ-gal培養(yǎng)基平板上，30℃轉(zhuǎn)化孵育2天。
17)從步驟13得到的再生的YPAD培養(yǎng)基平板上找出產(chǎn)生λ-gal的克隆株（在λ-gal培 養(yǎng)基平板上表現(xiàn)為藍(lán)染）。在以后的菌株生長(zhǎng)和處理中保持適當(dāng)?shù)倪x擇。
