小載體聚合酶鏈反應

材料與儀器

誘變轉座子基因組文庫質粒DNA
錨定囊泡引物1和2 、1 mol L MgCl2、普通小載體（UV)和mTn引物、轉座子誘變酵母菌株、合適的限制性內切核酸酶（如AZmI或DraI)和緩沖液、10×T4 DNA連接酶緩沖液、5 mmol L ATP、400 U μL T4 DNA連接酶（檢測于黏合末端連接單位）、5 U μL Tag DNA聚合酶和1O×緩沖液、2.5 mmol L 4 dNTP 混合液
加熱塊、自動化熱循環控制儀

步驟

1)準備小載體PCR，合成錨定囊泡引物。形成錨形囊泡如下：

a.配置一種水溶液，這種溶液中含有2?4 mmol/L的每種錨定囊泡引物1和2。

b.在加熱塊上以95℃孵育5 min變性。

c.加入1 mol/L MgCl2至溶液終濃度為2 mmol/L

通過從底部裝置撤掉加熱塊并將其放在試驗臺上直至冷卻到室溫使其變性。-20℃儲存至第5步。

2)合成普通小載體（UV)引物。合成與產生插入文庫的mTn互補的引物（mTn引物)。

如果使用LacZ插入文庫，推薦以下序列為mTn引物：5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3、mTn引物對應于mTn-3× HA/LacZ的反義鏈上的LacZ的5'端序列。

UV引物在序列上與部分錨定囊泡引物2相同（不互補如果要分析一個mTn-3× HA /GFP誘變菌株，推薦使用以下GFP引物序列：5'-CAT CAC CTT CAC CCT CTC CAC TGA C-3'。

3)從目的轉座子誘變酵母菌株制備基因組DNA

4)在20μL的反應體系中用10 U的AluI或DraI (經常用留有平端的刀片）消化1?3μg基因組DNA, 37℃過夜。消化后，65℃孵育20 min滅活酶。

使用的酶不能切割轉座子末端和mTn引物結合位點。

5)在步驟4的反應混合物中加入以下試劑：

5℃ 10×T4 DNA連接酶緩沖液

22.5μL滅菌水

1μL復性的錨定囊泡（在步驟1中得到）

0.5μL 5 mmol/L ATP

1μL (400 U) T4 DNA 連接酶

15% (m/V)聚乙烯乙二醇（任選）

16℃孵育9?24 h

6)按照下列步驟制備總量為100μL 的PCR混合物：

A．從步驟5的連接反應體系中取出5μL

B．在這5μL的量中加入以下試劑：

10μL 1O×Taq PCR 緩沖液

7μL無菌水

8μL 2.5 mmol/L 4dNTP 混合物

2.5 20μmol/L mTn 引物（步驟 2)

2.5μL 20 pmol/L UV 引物（步驟 2)

1μL (5 U) Taq DNA 聚合酶。

7)將混合物轉移到自動化熱循環控制儀上92℃變性2 min。在以下條件下進行PCR反應

20 s 92℃(變性)

30 s 67℃(復性)

45 s 72℃(延伸)

90 s 72℃(延伸)

8)從步驟7的反應混合物中取出80 ,用非變性瓊脂糖凝膠電泳法進行分析應該可以看到一約含有200?400 ng的DNA條帶。在TE 緩沖液中（約12μL)回收DNA。

9)用約4?6μL的回收產物，作DNA序列測定，以鑒定mTn插入的確切位點。