mTn誘變基因產(chǎn)物的表位標(biāo)記

材料與儀器

mTn誘變酵母菌株
pGAL-cre 含有2% (W V)棉籽糖的-Leu -Ura Raff CM缺失成分培養(yǎng)基平板和培養(yǎng)基 含有2% {m V)半乳糖的-Leu Gal CM缺失成分培養(yǎng)基 含有2% (m V)葡萄糖的-Leu Glc CM缺失成分培養(yǎng)基 5-FOA培養(yǎng)基平板（5-FOA) 丙三醇 無菌 30×
帶混合的孵育器

步驟

1)用pGAL-cre(pB277)標(biāo)準(zhǔn)操作轉(zhuǎn)化mTn誘變酵母菌株。在CM- Leu, -Ura缺失成分培養(yǎng)基平板上選擇轉(zhuǎn)化株。

此質(zhì)粒包含以下元件：amp、ori、CEN和LEU2。

2)將轉(zhuǎn)化株接種到2 mL的含有2% (m/V)棉籽糖的-Leu，-Ura的Raff/CM缺失成 分培養(yǎng)基里，棉籽糖作為碳源抑制GAL啟動(dòng)子。30℃通風(fēng)孵育直到培養(yǎng)物生長(zhǎng)到飽和狀態(tài)。

3)在2 mL含有2%的半乳糖的Gal/CM-Leu缺失培養(yǎng)基中100倍稀釋培養(yǎng)物，以半乳糖作為碳源。在2 mL含有2%的葡萄糖的Glc/CM-Leu失控培養(yǎng)基中100倍稀釋一份同樣的培養(yǎng)物，以葡萄糖為碳源，作為對(duì)照。30℃通氣培養(yǎng)2天。

一些菌株在半乳糖中生長(zhǎng)得很不好，但是半乳糖誘導(dǎo)有時(shí)很有效，盡管沒有可見的生長(zhǎng)跡象。

4)用以下方法檢驗(yàn)菌株URA3標(biāo)志物的丟失。

a.如果在2%的半乳糖的培養(yǎng)液中可見生長(zhǎng)，用無菌水100倍稀釋培養(yǎng)液，取10μL稀釋液。

b.如果在2%的半乳糖的培養(yǎng)液中沒有發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)，從未經(jīng)稀釋的培養(yǎng)液中取10μL。

c.用無菌水100倍稀釋2%的葡萄糖培養(yǎng)液，取10μL稀釋液。

將取出的培養(yǎng)液滴在5-FOA培養(yǎng)基平板上；通過劃散小滴隔離單克隆。30℃孵 育5-FOA培養(yǎng)基平板直到在接種了在半乳糖中生長(zhǎng)的菌株的培養(yǎng)基平板上看到 菌株生長(zhǎng)。

根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，90%以上的被分析的細(xì)胞因半乳糖誘導(dǎo)造成由Cre重組酶介導(dǎo)的mTn編碼的URA3標(biāo)記切除。轉(zhuǎn)座子編碼的URA3基因丟失表現(xiàn)為克?。ㄔ诎肴樘桥囵B(yǎng)基培養(yǎng)的菌株） 在5-FOA培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)。因?yàn)槠咸烟且种艭re重組酶表達(dá)，所以在葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的 菌株在5-FOA培養(yǎng)基平板上應(yīng)該不生長(zhǎng)或很少生長(zhǎng)。另一種方法也可印證：將第4步得到的 稀釋培養(yǎng)液放入CM培養(yǎng)基中并影印在CM-Um缺失成分培養(yǎng)基上，30℃孵育兩天。在半乳糖生長(zhǎng)的培養(yǎng)液產(chǎn)生的Ura-細(xì)胞應(yīng)比在葡萄糖中的多100倍。

5)從丟失了URA3 (半乳糖誘導(dǎo)后的獨(dú)特標(biāo)志)的菌株中收集單克隆，于-70℃存放在15% (m/V)的丙三醇中。