細(xì)胞銅死亡的檢測(cè)

簡(jiǎn)介

銅依賴性細(xì)胞死亡是一種新形式的細(xì)胞死亡方式，被定義為非凋亡性細(xì)胞死亡途徑。在健康的細(xì)胞中，銅離子通過(guò)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)通過(guò)線粒體中的氧化還原酶等參與氧化-磷酸化反應(yīng)，完成細(xì)胞代謝過(guò)程。

但是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度過(guò)高，或者銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氧化還原酶等出現(xiàn)缺失時(shí)，過(guò)量銅離子就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞膜 DNA 損壞、從而影響細(xì)胞的正常功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

原理

銅直接與三羧酸（TCA）循環(huán)的脂酰化組分相結(jié)合。然后，這些銅結(jié)合的脂化線粒體蛋白發(fā)生聚集和 Fe-S 簇蛋白降解觸發(fā)了蛋白水毒性應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

用途

幫助人們更好地了解銅離子在細(xì)胞內(nèi)的作用；有助于開(kāi)發(fā)更有效的銅離子調(diào)節(jié)劑促進(jìn)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)；對(duì)細(xì)胞銅死亡的研究還有助于診斷和治療相關(guān)疾病。

材料與儀器

試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、Disulfiram（DSF）、0.25% 胰酶（含 EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、CuCl2 溶液、抗體（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH 和 HRP）、DAPI 染料、SDS-PAGE 凝膠

步驟

1、將細(xì)胞放置在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用 0.25% 胰酶消化后收集細(xì)胞，用 PBS 重新懸浮調(diào)整細(xì)胞濃度為 2 × 103 個(gè)/孔接種于 96 孔板中；

3、提前 30 分鐘在培養(yǎng)中加入 1 μM 的 CuCl2 溶液，再在每孔中加入 0.05~1.6 μM 的 DSF 處理細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組（即不添加 CuCl2 的 DSF 處理組），置于于 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4、在處理細(xì)胞 16~24 小時(shí)后，重復(fù)三次加入 0.05~1.6 μM 的 DSF，72 小時(shí)后通過(guò)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，并在顯微鏡下觀察；

5、將步驟 3 的處理組細(xì)胞用 DSF 處理 2 小時(shí)后用 PBS 洗滌，用 10% 福爾馬林重懸，在室溫下孵育固定；

6、使用 FDX1 抗體作為一抗孵育細(xì)胞，用 PBS 洗去多余的一抗后加入熒光標(biāo)記的二抗，再用 PBS 緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，使用核染色劑（DAPI）對(duì)樣品進(jìn)行染色于顯微鏡下觀察；

7、同樣將 DSF 處理 2 小時(shí)后的細(xì)胞加入蛋白酶抑制劑進(jìn)行裂解，洗脫蛋白至 SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺薄膜中，轉(zhuǎn)膜封閉后加入一抗（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH）于 4 ℃ 孵育過(guò)夜，然后加入二抗 HRP 室溫?fù)u床孵育 2 小時(shí)，洗滌后置于發(fā)光成像分析系統(tǒng)中觀察。

注意事項(xiàng)

（1）細(xì)胞的培養(yǎng)條件需要嚴(yán)格控制，溫度、濕度、CO2 濃度、培養(yǎng)基配方以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性；

（2）銅離子濃度和處理時(shí)間要控制，過(guò)高的濃度和長(zhǎng)時(shí)間的處理都會(huì)導(dǎo)致不必要的毒性和干擾，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

（3）用銅離子載體藥物 DSF 處理時(shí)采用電脈沖，避免因藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生氧化應(yīng)激；

（4）細(xì)胞在固定過(guò)程中避免因額外壓力或其他因素造成細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。染色試劑的選擇應(yīng)基于具體情況進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整，并注意染色試劑與細(xì)胞樣本的兼容性；

（5）蛋白檢測(cè)指標(biāo)中，重點(diǎn)觀察 Fe-S 蛋白的變化，而凋亡相關(guān)蛋白的含量不會(huì)發(fā)生變化，若凋亡相關(guān)蛋白有明顯變化應(yīng)該考慮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的操作方法是否有誤。