seahorse 檢測(cè)細(xì)胞能量代謝狀況

簡(jiǎn)介

使用 seahorse 儀器檢測(cè)細(xì)胞能量代謝狀況，具體包括細(xì)胞有氧呼吸和糖酵解。

原理

有氧呼吸和糖酵解是細(xì)胞內(nèi)兩條主要的能量生產(chǎn)途徑，前者可通過(guò)加入不同的線粒體電子傳遞鏈藥物來(lái)測(cè)得細(xì)胞呼吸氧耗率，后者則通過(guò)加入寡霉素抑制有氧呼吸來(lái)測(cè)得細(xì)胞產(chǎn)酸率。

用途

測(cè)量細(xì)胞能量代謝，細(xì)胞有氧呼吸情況，細(xì)胞糖酵解情況。

材料與儀器

Seahorse XFe96 儀器；Seahorse XF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)定試劑盒

步驟

Seahorse 細(xì)胞能量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)操作在細(xì)胞類型（貼壁或懸浮）、細(xì)胞數(shù)量、藥物劑量濃度上均可能會(huì)有區(qū)別，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行調(diào)整，以下為貼壁細(xì)胞的一種線粒體壓力測(cè)試方案：

一、準(zhǔn)備工作

1. 接種貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞接種在 XF96 細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔 80 μL 培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)在 5~20 k/well 為佳，待細(xì)胞放入培箱中培養(yǎng)固定 1 h 后，再向每孔加入 70μL 培養(yǎng)基；在背景校正孔中加入 150 μL 培養(yǎng)基，不加細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放入 37 ℃ CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

2. 水化探針板：在水化板（Utility Plate）中加入 200 μL/孔的無(wú)菌水，再放上探針板和蓋子，輕微移動(dòng)排出氣泡后，在 37 ℃ 無(wú) CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜；同時(shí)取出至少 20 mL 的 XF 校準(zhǔn)液放入離心管中，37 ℃ 無(wú) CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜；

二、上機(jī)檢測(cè)

1. Seahorse Xfe96 系統(tǒng)預(yù)熱：至少提前 5 小時(shí)打開(kāi)儀器、電腦和軟件進(jìn)行預(yù)熱；

2. 水化探針板：次日去除探針板裝置，棄去 Utility Plate 中的無(wú)菌水，每孔加入 200 μL XF 校準(zhǔn)液，放上探針板和蓋子后，在 37 ℃ 無(wú) CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中水化 45~60 min；

3. 配置檢測(cè)液：配置方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整；簡(jiǎn)而言之，一塊培養(yǎng)板配置約 100 mL 檢測(cè)液（97 mL 103575-100 試劑盒中加入 1 mL glucose（終濃度為 10 mM）、1 mL pyruvate(終濃度為 1 mM)、1 mL glutamine(終濃度為 2 mM)），調(diào)整檢測(cè)液 PH 至 7.4，然后將使用 0.22 μm 細(xì)胞濾器過(guò)濾后放入 37 ℃ 溫育備用；

4. 細(xì)胞換液：棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基（留下 20 μL 覆蓋細(xì)胞），加入 200 μL 檢測(cè)液清洗 2 遍，徹底去除檢測(cè)液，再加入 180 μL 檢測(cè)液，將細(xì)胞放入 37 ℃ 無(wú) CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中 60 min 等待上機(jī)；

5. 配藥：從試劑盒中取出一包藥物，用檢測(cè)液進(jìn)行稀釋，具體見(jiàn)下表

推薦 Oligomycin 上機(jī)終濃度為 1.5 μM，Rot/AA 上機(jī)終濃度為 0.5 μM，F(xiàn)CCP 上機(jī)終濃度為 0~2 μM，2~3 mL 藥物工作液為 10x 濃度裝載入探針板，例如：想獲得終濃度為 1.5 μM 的 Olygomycin，需加入 630 μL 檢測(cè)液重懸，混勻后從重懸液中取出 450 μL 并加入 2 550 μL 檢測(cè)液配置 3 mL 15 μM 的工作液；

6. 加藥：探針板中每孔加入 20 μL 配制好的藥物，加藥時(shí)保持探針板水平，槍頭略傾斜于探針板，槍頭深入孔中但不能沒(méi)入液體，藥物不能掛壁；加藥順序?yàn)椋海▽?shí)驗(yàn)所需細(xì)胞藥物）-Oligomycin-FCCP-Rot/AA。

7. 上機(jī)運(yùn)行：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成組定義設(shè)置，StartRun 運(yùn)行實(shí)驗(yàn)，按照提示將去掉蓋子的探針板防止于托盤(pán)上，進(jìn)行校準(zhǔn)（約 20 min）；校準(zhǔn)完畢后將 Utility Plate 換成細(xì)胞培養(yǎng)板，并開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞能量代謝測(cè)試，測(cè)量結(jié)束后點(diǎn)擊 Eject 取出細(xì)胞培養(yǎng)板和探針板，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

注意事項(xiàng)

細(xì)胞狀態(tài)最為重要，需要培養(yǎng)好細(xì)胞；貼壁細(xì)胞貼壁后細(xì)胞匯合度達(dá) 80~90% 為佳，并且細(xì)胞數(shù)量與藥物濃度之間的比例需要把控好，做到能夠檢測(cè)到合適范圍的氧耗率或產(chǎn)酸率，又不會(huì)過(guò)度抑制細(xì)胞活性。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 探針板的水化時(shí)間？

4~72 小時(shí)，建議過(guò)夜。

2. 檢測(cè)液中可以加入血清嗎？

不建議加入，血清會(huì)影響檢測(cè)液的緩沖能力，也可能與藥物發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測(cè)效果。

3. 溶好的藥物可以使用多長(zhǎng)時(shí)間？

藥物和檢測(cè)液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

4. 加入 FCCP 后，OCR 沒(méi)有升上去？

需要考慮是否細(xì)胞活性不佳，或者 Oligomycin 加入過(guò)多抑制了最大呼吸。

5. FCCP 劑量摸索如何設(shè)置？