細(xì)胞鋪板

原理

單細(xì)胞鋪板是將細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔中預(yù)先加入適量完全培養(yǎng)基，充分晃動使培養(yǎng)基浸潤整個孔底，隨后滴加重懸好的細(xì)胞懸液，充分搖晃混勻，將細(xì)胞分散，不抱團也不過分空蕩。

材料與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、無菌 PBS、0.25% 胰蛋白酶

移液器、無菌槍頭、無菌 EP 管、6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)板

步驟

（1）細(xì)胞培養(yǎng)一段時間，選擇生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞；

（2）棄去舊培養(yǎng)基，PBS 輕柔潤洗 3 次；

（3）棄 PBS，加入 1 mL 0.25% 的胰蛋白酶，覆蓋住細(xì)胞為宜；

（4）置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 2 min 左右，充分消化細(xì)胞；

（5）取出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察，搖晃培養(yǎng)皿見細(xì)胞縮小變圓且輕微浮動即可及時終止，加等量的完全培養(yǎng)基終止消化；

（6）輕柔混勻，1000 rpm 離心 5 min，棄上清；

（7）完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后按 6-8×105 個/孔接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔已提前加好 1 mL 完全培養(yǎng)基，輕柔混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項

（1）實驗前 30 min 對細(xì)胞間及超凈臺進(jìn)行充分紫外照射；

（2）進(jìn)入細(xì)胞間更換無菌衣，無菌拖鞋等；

（3）細(xì)胞接種密度 6-8×105 個/孔，需要根據(jù)孔板大小而定，以鋪至孔的 60~70% 為宜；

（4）胰蛋白酶消化的時間依據(jù)細(xì)胞類型而定，最初實驗需要設(shè)置時間梯度摸索；

（5）加培養(yǎng)基要充分混勻，保證細(xì)胞分布均勻，而不會一處多一處少呈現(xiàn)抱團現(xiàn)象。