球狀體形成測定

簡介

腫瘤干細胞 （CSC） 是指腫瘤內(nèi)不僅具有自我更新能力還擁有較強侵襲遷移能力的那一小部分細胞，常常在化療治療后驅(qū)動腫瘤惡變和復(fù)發(fā)，與腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

傳統(tǒng)上，腫瘤干細胞會從癌細胞系和腫瘤活檢組織中分離出來，并在三維腫瘤球狀體懸浮培養(yǎng)物中生長，成球能力是腫瘤干細胞體外鑒定的一個重要方法，目前腫瘤細胞的成球?qū)嶒灒ǔ汕虼笮〖皵?shù)目）是衡量腫瘤細胞干性的主要手段。判斷單個細胞在適宜的條件下自我更新的能力通常用細胞球形成的效率來表示。

用途

球狀體形成測定主要應(yīng)用在癌癥干細胞研究和人類腫瘤細胞的研究中。通過此方法可以評估各種不同的細胞表面標志物和信號通路對腫瘤干細胞樣細胞（CSC）表型的影響，同時此方法可有效的檢測惡性細胞、腫瘤發(fā)生以及評估癌細胞的耐藥性。

材料與儀器

癌細胞（本文以結(jié)直腸癌細胞為例）

RPMI 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基

L-谷氨酰胺、抗生素（青霉素/鏈霉素）

EDTA 溶液、6/12/24/96 孔板、燒瓶

試管等

步驟

一、干細胞培養(yǎng)基的制備

1. 使用 DMEM/F-12 培養(yǎng)基。可選擇補充 1 U/ml 青霉素/鏈霉素。

2. 加 10 ng/ml 濃度的人重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、10 ng/ml 濃度的人重組表皮生長因子（EGF）和 N-2（100 X）補充劑等生長因子。

二、球狀體形成

1. HCT116 細胞在 RPMI 培養(yǎng)基中生長，在組織培養(yǎng)瓶中添加 10% 滅活胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。

2. 在 37 °C 和 5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 3~4 天更換一次培養(yǎng)基。（本培養(yǎng)基不含青霉素/鏈霉素）。

3. 當細胞融合 60~80%，抽吸培養(yǎng)基后用 3 ml 預(yù)熱無菌 PBS 洗滌 2 次。加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中消化 5 分鐘。

4. 在每個培養(yǎng)瓶中加入 6 ml 全培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，上下移動細胞以獲得單細胞懸浮液。將完整的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 15 ml 標記的 Falcon 試管中。

5. 在室溫下將細胞 350×g 離心 5 分鐘，抽吸上清，將微球重懸于 4~6 ml 無菌 PBS 中。

6. 用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，調(diào)整細胞數(shù)量至每 2 ml 完整干細胞培養(yǎng)基中含有 3000 個。

7. 精確計數(shù)后，取 200 μL 非血清培養(yǎng)基以 200 個細胞/孔密度加入 96 孔板，每組 10 孔。并在 37 °C和 5% CO2 的標準條件下培養(yǎng)細胞兩周。第 14 天觀察到具有剛性邊緣的結(jié)腸球。

8. 每 3~4 天更換一次新鮮制備的完整干細胞培養(yǎng)基。當結(jié)腸球生長為漂浮的球形菌落時，更換培養(yǎng)基。

9. 使用熒光顯微鏡對每組隨機選取的 5 個區(qū)域進行成像，觀察細胞成球情況并計算細胞成球效率，球體百分比按球體數(shù)/200 計算。

注意事項

添加生長因子時，應(yīng)在使用前添加生長因子。

常見問題

球體形成的第 5 步，混合細胞時容易產(chǎn)生氣泡，應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生。