MTT 法檢測細胞毒性與增殖實驗

簡介

通過 MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍）檢測細胞生長、細胞毒性、細胞增殖的常用方法。

原理

活細胞中的線粒體中的一些脫氫酶，能夠使外源性的 MTT 還原為難溶性的藍紫色結晶物，而死細胞無此活性。藍紫色結晶物可以溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，用酶標儀測定 490 nm 波長的吸光度（OD 值）即可定量檢測細胞的毒性與增殖情況。細胞增殖與吸光度成正比，細胞毒性與吸光度成反比。若用成熟的試劑盒檢測，則測定 570 nm 的吸光值。

用途

細胞增殖、細胞毒性的檢測。

材料與儀器

細胞、 96 孔培養板、移液槍、槍頭、15 ml 離心管、PBS、胰蛋白酶、細胞培養基、酶標儀、二甲基亞砜、 MTT

步驟

1、根據說明書配制 MTT 溶液，用 PBS 配制終濃度為 5 mg/ml，配制后可適當分裝放 -20 ℃ 避光保存。

2、適當濃度的細胞接種到 96 孔板后按正常實驗需求處理。

3、培養結束后，每孔加入 10 μl MTT 溶液， 37 ℃ 繼續孵育 4 h。

4、小心吸去孔內的上清液（對懸浮細胞要求離心，離心后棄上清液），加入 150 μl DMSO，搖床上低速振蕩 10 min，使紫色結晶溶解。在酶聯免疫檢測儀上，490 nm 波長下測定各孔光吸收值（OD 值），記錄結果。

5、除了 DMSO，還可選擇成熟的 MTT 試劑盒檢測，則每孔加入 100 μl 結晶溶解液，在細胞培養箱中繼續孵育 3~4 小時，至結晶全部融解。測定 570 nm 處的吸光值。

注意事項

1. 酶聯免疫檢測儀測試的 OD 值僅在適當的細胞濃度時與細胞數目呈線性關系。因此，在實驗時，必須選擇適當的細胞接種濃度，一般 96 孔板每孔 1 000~5 000 個細胞左右，注意接種到培養板后要混勻，防止細胞成團分布不均。

2. 血清物質會干擾 OD 值，因此，在顯色后盡可能將孔內殘余培養基吸凈。

3. 設空白對照。與試驗孔平行設定不加細胞僅加培養基的空白對照孔，其他實驗步驟保持一致。比色時，以空白孔調零。

4. 96 孔板進行實驗時，若培養時間較長需注意蒸發問題。可采取棄用周圍一圈，改用 PBS 或培養基替代。

5. MTT 最好現用現配，避免反復凍融。低溫下容易凝固，需融解后再使用。

6. 測定 OD 值前，需注意細胞孔板中無氣泡。

7. 加入 MTT 生成結晶后，去除上清液需小心不要把結晶去掉。

8. 結晶一定要完全融解后再測定 OD 值。