transwell 實驗

簡介

細胞遷移是指細胞在外界信號的作用下從一個位置（區域）移動到另一個位置（區域）的過程，這個過程在生物體內發揮著非常重要的生理和病理學作用，比如損傷修復、腫瘤轉移、免疫細胞的遷移、組織修復等。

用途

細胞遷移實驗是一種常用的體外實驗方法，用于評估細胞遷移能力的變化，以及探究與細胞遷移相關的分子機制。

材料與儀器

顯微鏡、Transwell 小室、細胞培養板孔板、無血清 DMEM、10% 胎牛血清、DMEM 和 1640 培養基、DMEM 完全培養基、1640 完全培養基（也可加到 20% 血清）、無菌 PBS、棉簽、胰酶、4% 多聚甲醛固定液、結晶紫染液。

步驟

1.使用前進行基底膜水化

每孔加 50 μl 無血清培養液，37℃ 室溫下 30 min 進行基底膜水化。

2.制備細胞懸液

①先讓細胞撤血清饑餓 12～24 h，進一步去除血清的影響。

②消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用 PBS 洗 1～2遍，用含 BSA 的無血清培養基重懸。調整細胞密度至 5×105 個/ml。

3.接種細胞

①取細胞懸液 100 μl 加入 Transwell 小室。

②孔板下室加入 600 μl 含 10% FBS 的培養基。

③培養細胞：常規培養 12～48h（主要依細胞遷移能力而定）。

4.結果統計

直接計數法，「貼壁」細胞計數，這里所謂的「貼壁」是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色可在鏡下計數細胞。

取出 Transwell 小室，棄去孔中培養液，用無鈣的 PBS 洗 2 遍，甲醇固定 30 分鐘，將小室適當風干。

0.1% 結晶紫染色 20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用 PBS 洗 3 遍。熒光顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數，取平均值，統計分析。

注意事項

1. 下層培養液和小室間常會有氣泡產生。一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，因此在種板的時候要特別留心。一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。

2. 培養細胞的時間為 24h 較常見。時間點的選擇除了要考慮到細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

3. Transwell 孔徑的選擇需要考慮實驗的目的和實驗細胞的大小。如不涉及研究細胞運動能力通常是選擇 4 μm 或者 3 μm。

4. 細胞懸液的制備數量要合適：

細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數法統計結果的話將難以計數；

而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。

5. 細胞在小室內的形態有可能不是正常培養貼壁的形態，而是圓形的，仍是懸浮時的形態，不過會聚集成團，屬正常現象（別人的經驗，注意觀察）。

6. 如果研究細胞侵襲實驗，則需要在第一步進行 Matrigel 基質膠鋪板。

7. 細胞接種時盡量均勻，建議沿著壁緩慢加入。