RT-PCR技術概述
RT-PCR簡介
RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。
首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。
RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。
無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
使用天為時代公司的總RNA提取系統（如目錄號 DP405和DP406），所獲得的RNA的純度高，基因組DNA污染少，用于RT-PCR系統可得到滿意結果。
用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。
RT-PCR引物的選擇
| 隨機引物 | 適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。 |
| Oligo dT | 適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。 |
| 基因特異性引物 | 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。天為時 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特別適合于與基因特異性 引物連用。 |
RT-PCR影響因素
RT-PCR反應受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環數等。
◇建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實驗。
◇對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結合，因而提高特異產物的得率。
◇大多數目標RNA經40輪PCR反應就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數到45-50次。
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