大鼠肝星狀細胞培養實驗

原理

將小鼠的肝細胞從機體中取出，經胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖。

材料與儀器

雄性 SD 大鼠
戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺盼蘭
手術器械 尼龍網 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

步驟

一、實驗步驟

1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹，進行門靜脈插管。

2. 以D-Hanks‘液灌注，同時剪開下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。

3. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min，尼龍網過濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。

4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g 離心16 min 后取界面細胞。

5. 以HBSS重懸后再次離心收集細胞，以DMEM重懸后進行細胞計數，并判斷存活率和產量，最后按照常規方法接種(105 細胞/cm2 )，次日換液，以后每2-3 天換液一次。

6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細胞突起回縮(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA，可以不需離心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種，然后繼續培養(5% CO2，37℃)。

二、結果

接種次日，光鏡下可見細胞呈星芒狀，胞質內有脂滴，熒光鏡下328  nm 處見自發熒光。

注意事項

1.  進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細胞激活后才表達。

2.  采用無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時間更難控制！實驗采用原代培養的或傳代后9代內的細胞(最好5代以內)。

常見問題

電鏡觀察：接種次日，光鏡下可見細胞呈星芒狀，胞質內有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發熒光。
一、討論
進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin  和α-SMA；后者在細胞激活后才表達。也采用過無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時間更難控制！實驗采用原代培養的或傳代后9代內的細胞(最好5 代以內)。
二、文獻

1. 袁桃霞，張錦生，張月娥，等. 大鼠肝 Ito 細胞的體外培養及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫科大學 學報,1996,23(2):90-93.

2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α; gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1309-1318.