補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)

原理

帶有特異抗原的靶細(xì)胞（如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下，引起靶細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺(tái)盼藍(lán)）可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，故可用于指示死細(xì)胞或?yàn)l死細(xì)胞，而活細(xì)胞不著色。此即補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒試驗(yàn)，利用細(xì)胞毒試驗(yàn)可以檢查細(xì)胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。

本實(shí)驗(yàn)中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T 細(xì)胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1 的單克隆抗體通過補(bǔ)體的協(xié)同作用，可殺傷95％以上的胸腺細(xì)胞。

材料與儀器

小鼠
Hank's液 抗小鼠Thy-1的單克隆抗體 補(bǔ)體 伊紅-Y染液
解剖器械 平皿 不銹鋼網(wǎng) 試管 吸量管 尖吸管 載玻片 蓋玻片

步驟

1.  小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備

將 4～6 周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank's液的平皿中，在100 目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩，放入試管，離心1000 rpm，5 分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank's液中，配成1×107 /ml細(xì)胞懸液。

2.  取試管3 支，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107 /ml胸腺細(xì)胞懸液、抗小鼠Thy-1 的單克隆抗體（最適稀釋度）及Hank's液，放入37 ℃水浴30 分鐘。

3.  取出后每管加入1 ％伊紅-Y 染液1 滴，混勻，室溫放置2 分鐘。

4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3 管中細(xì)胞死活情況。

注意事項(xiàng)

1.  胸腺細(xì)胞制備速度要快，且需在冰浴中進(jìn)行操作，以保持細(xì)胞活力。

2.  抗Thy-1 的單克隆抗體和補(bǔ)體的效價(jià)要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定。

3.  細(xì)胞對(duì)照管死細(xì)胞數(shù)若超過5％，實(shí)驗(yàn)需重新做。

4.  細(xì)胞滴加到載玻片上后長(zhǎng)時(shí)間放置不檢測(cè)也可導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。

常見問題

一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果  

死細(xì)胞呈紅色，無(wú)光澤且腫脹變大；活細(xì)胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。

高倍鏡下計(jì)數(shù) 200 個(gè)細(xì)胞并計(jì)算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
計(jì)算公式如下：