方案25.5 神經聚集物

原理

從妊娠 17 d 或 18 d 的胎鼠取出腦（與地方動物倫理委員會聯(lián)系），將腦制成單細胞懸液。通過在用瓊脂預涂的多孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，使腦細胞形成聚集物。在 20 d 的培養(yǎng)過程中，聚集物中的細胞形成成熟的器官樣腦結構。

材料與儀器

PBSA Ⅱ型胰蛋白酶
Dulbecco改良的Eagle’s培養(yǎng)液
瓊脂 多孔組織培養(yǎng)板 Petri培養(yǎng)皿 試管 手術刀 解剖剪 外科鑷 錐形瓶 水浴箱

步驟

按照以下步驟用瓊脂培養(yǎng)液涂多孔培養(yǎng)板的孔：

(a)在錐形瓶中制備 3% 瓊脂儲存溶液（每100 ml D-PBSA 中加入 3 g 瓊脂）；

(b)在沸水中將燒瓶加熱直至瓊脂溶解。在沸水中放一個空錐形瓶，將 10 ml 熱瓊脂溶液注入此燒瓶中；

(c)向燒瓶內慢慢加入預溫的完全生長培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)液在瓊脂內的濃度達到 0.75%；

(d)在多孔培養(yǎng)板的每個孔內加入 0.5 ml 溫培養(yǎng)液-瓊脂溶液；

(e)使瓊脂冷卻和膠化。

這些多孔培養(yǎng)板可在冷藏箱內儲存一周。

1. 在無菌條件下，從妊娠 17 d 或 18 d 胎鼠的同窩仔切出整個腦，然后將腦組織放入含 D-PBSA 的 10 cm Petri 培養(yǎng)皿中。

2. 用手術刀將組織切成約 0.5 cm3 小塊。

3. 將組織塊移入一個試管，用 D-PBSA 洗 3 次。每次清洗之間讓組織沉降至管底。

4. 向組織內加入 5 ml 胰蛋白酶溶液，在 37℃水浴箱中消化 5 min。

5. 用 Pasteur 吸管吹打約 20 次，將組織分散。

6. 讓組織沉降 3 min，然后將無組織塊的混著細胞懸液移入含 5 ml 生長培養(yǎng)液的試管內。

7. 向未分散的組織加入 5 ml 新鮮的胰蛋白酶溶液，重復消化和分散步驟 2 次以上。

8. 將細胞懸液離心（200 g ，5 min )。

9. 吸去上清液，用 10 ml 生長培養(yǎng)液混懸和收集細胞。

10. 計數(shù)細胞，在每個涂瓊脂的孔內加入 1 ml 細胞懸液（3x106 個細胞）。

11. 將多孔培養(yǎng)板放入 CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 48 h 。

12. 將細胞聚集物移入無菌的 10 cm Petri培養(yǎng)皿中，并加入 10 ml 生長培養(yǎng)液。

13. 用 Pasteur 吸管將大的聚集物分別移到新的涂有瓊脂的多孔板。

14. 每 3 d 更換培養(yǎng)液 1 次。小心地吸去原有培養(yǎng)液，添加新鮮培養(yǎng)液，覆蓋聚集物。

在 20 d 培養(yǎng)過程中，細胞聚集物可變?yōu)榍蛐危l(fā)育形成器官樣結構。