非固定細胞的無洗染色

材料與儀器

細胞
蛋白酶 NST-DAPI 緩沖液 MFM 檸檬酸緩沖液 DNA 染色 裂解溶液
尼龍篩

步驟

一、組織培養細胞的染色
1. 通過對懸浮培養中的細胞傾析或對單層培養的細胞蛋白酶消化來收獲細胞。計數細胞，800 g 慢速離心 3 分鐘沉淀細胞。

2. 細胞染色。

3. 在 NST-DAPI 緩沖液中于冰上孵育細胞 15 分鐘。

4. 用 35 μm 孔徑的尼龍篩目過濾細胞。

5. 用流式細胞計量術分析染色細胞。

二、固體組織的染色
1. 如冷凍，將組織片放入裝有補充 5% 小牛血清和 10% DMSO 的 MFM 的冷凍管中，置冰上，-70℃ 冷凍。制備時，在 37℃ 水浴中快速融解。不用的組織可以重新冷凍。

2. 組織染色。

(1) PI 染色

① 取約 2~3 mm3 的組織片放入 60 mm 的培養皿中，加 0.5~1.0 ml 檸檬酸緩沖液，將培養皿置冰上或冷藏盒中。

② 用 2 枚解剖刀片將樣品交叉切碎，剪切切碎的樣品，首先幾次通過 Rainin P1000 加樣器尖，然后幾次上下通過結核菌素注射針。不要企圖將明顯過大的片段通過注射針。

③ 將樣品轉移到一 5 ml 的一次性培養管中，取 200 μl 樣品放入一支新管，加入 800 μl DNA 染色/裂解溶液，20 μl 煮沸過的 RNA 酶 A 進行步驟 3。

(2) DAPI 染色

① 取約 2~3 mm3 的組織片放入 60 mm 的培養皿中，加 0.5~1.0 ml NST-DAPI 緩沖液，將培養皿置冰上或冷藏盒中。

② 用 2 枚解剖刀片將樣品交叉切碎，剪切切碎的樣品，首先幾次上下通過結核菌素注射針。不要企圖將明顯過大的片段通過注射針。

③ 將樣品轉移到一 5 ml 的一次性培養管中。

3. 在冰上孵育培養管 15 分鐘。

4. 用 35 μm 孔徑的尼龍篩過濾樣品。

5. 用流式細胞計量術分析。樣品可加入 10% DMSO 冷凍于 -70℃，用于以后重新分析或分類。