綠膿桿菌的培養與鑒定

簡介

綠膿桿菌（銅綠假單胞菌）是一種需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水體和醫院等環境中，是一種常見的致病菌。綠膿桿菌的培養通常使用液體培養基或固體培養基，通過提供適當的營養物質和條件，促進綠膿桿菌的生長和繁殖。測定綠膿桿菌的方法包括生化試驗、分子生物學方法、熒光染色法等。

用途

綠膿桿菌的培養和測定常用于基礎科學研究、醫學診斷、食品衛生檢測等領域。

材料與儀器

綠膿桿菌菌株、液體培養基、固體培養基、試管、培養皿、生化試劑、熒光染色劑等。

步驟

1、培養基的制備：將適量的營養肉湯培養基（BHI）或大腸桿菌 LB 培養基加入適量的蒸餾水中，混合均勻，然后加熱至完全溶解，再進行高壓滅菌。

營養肉湯培養基配方：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g（液體培養基不含），蒸餾水 1.0 L，pH 7.0。

2、培養基的接種：在滅菌的培養基中加入所需的抗生素（如果需要），然后用無菌技術將綠膿桿菌接種到培養基中。

3、培養條件的設置：將接種好的培養基置于 37 ℃ 恒溫培養箱中，培養 18~24 小時。

4、菌落的觀察：觀察培養皿中的菌落形態，綠膿桿菌的菌落通常呈現出灰色、綠色或黃綠色，呈不規則形狀，邊緣模糊，表面光滑或粗糙。

5、細菌涂片的制備：用無菌的鐵絲環取一定數量的菌落，涂抹于玻璃片上，然后用火燒殺菌。

6、細菌涂片的染色：采用革蘭染色法對細菌涂片進行染色。

① 初染：在菌膜上滴加結晶紫，以蓋滿菌膜為度，約 1 分鐘后，用細水流將染液沖洗。

② 酶染：滴加盧戈氏碘液數滴，約 1 分鐘后輕輕沖洗。

③ 脫色：滴加 95% 酒精 3～4 滴，輕輕晃動玻片數秒鐘，傾斜玻片棄去酒精，如此反復數次后，流下的酒精幾乎無色或稍呈淡紫色，最后沖洗。

④ 復染：滴加稀釋復紅染液數滴，約 1 分鐘后沖洗。

⑤ 染色完畢后，用吸水紙將玻片吸干、干燥處理，滴加香柏油，鏡檢。

7、細菌的鑒定：根據觀察到的菌落形態、細菌涂片的形態以及生化測試的結果等綜合判斷，確定綠膿桿菌的種類。

8、附錄：

1）綠膿桿菌的菌落形態通常具有以下特征：

形狀：綠膿桿菌的菌落形狀不規則，呈現出分叉、分枝或網狀的形態。

顏色：綠膿桿菌的菌落顏色通常呈現出灰色、綠色或黃綠色。

大小：綠膿桿菌的菌落大小通常在 2~3 毫米左右。

邊緣：綠膿桿菌的菌落邊緣通常模糊不清，呈現出分叉、分枝或網狀的形態。

表面：綠膿桿菌的菌落表面通常光滑或粗糙，有時也會呈現出凹凸不平的形態。

2）氧化/還原測試：綠膿桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性。通過觀察氧化還原指示劑的變化，可以確定綠膿桿菌的氧化還原性。

3）酸堿度測試：綠膿桿菌通常是產生酸的，可以通過酸堿指示劑的變化來檢測綠膿桿菌的酸堿度。

4）碳水化合物測試：綠膿桿菌通常可以利用葡萄糖和乳糖等碳水化合物進行代謝。可以使用含有這些碳水化合物的培養基來測試綠膿桿菌。

注意事項

1）綠膿桿菌菌株的選擇應根據實驗需求和綠膿桿菌的特性進行選擇。

2）培養過程中應注意無菌操作，避免雜菌和細菌的污染。

3）培養條件的設置應根據綠膿桿菌菌株的生長特性進行設置，以促進其生長和繁殖。

4）生化試驗和分子生物學方法應根據實驗設計選擇合適的方法和試劑，避免誤差。

5）熒光染色法應注意熒光染色劑的濃度和染色時間，避免影響結果的準確性。

6）常見問題包括菌落污染、菌株不純、生長速率過慢或過快等。

7）操作者注意防護措施，避免自身感染。