病毒滅活試驗——低 pH 孵放技術

簡介

低 pH 孵放技術是一種病毒滅活方法，適用于水痘疫苗、流感疫苗等多種病毒。該方法通過降低 pH 值和提高溫度來滅活病毒，從而保證疫苗的安全性。

原理

該方法本質是在病毒顆粒中緩慢地增加固定的低 pH 值，引起其結構的改變和失活。在體外的情況下，病毒普遍不能耐受滅活過程中降低 pH 值，高溫等條件，因此通過該實驗方法可以實現對病毒顆粒的安全滅活。

用途

病毒滅活是制備活疫苗或不活疫苗的一種重要手段。該實驗方法可以用于制備水痘疫苗和流感疫苗，確保疫苗的安全性和有效性。

材料與儀器

① 病毒懸液

② 0.1mol/L NaH2PO4

③ NaCl

④ 0.1mol/L PBS

⑤ 馬來酰亞胺哌嗪（MOPS）

⑥ 低溫冰箱

⑦ 微孔板

⑧ 無菌平板

⑨ 硫酸銨

⑩ 酚紅指示劑

? 手套、口罩、護目鏡等安全護具

步驟

1、準備實驗環境：工作區表面清潔干凈，排除任何可能造成樣本受污染的因素。

2、穿戴安全護具：戴上手套、口罩、護目鏡等安全護具，避免病毒樣本的直接接觸。

3、準備樣本：將病毒樣本從儲存容器中提取，并將其加入 1.5 ml 離心管中。

4、加入磷酸鹽緩沖液：向病毒樣本中加入足夠的 PBS 緩沖液，將其濃度調至期望的稀釋度。

5、溶于低 pH 緩沖液中：將病毒樣本與 PBS 緩沖液的混合物徹底溶于低 pH 緩沖液中，攪拌均勻。

6、孵育：設置一個適當的孵化時間、溫度和低 pH 值，以保證病毒樣本在低 pH 條件下被滅活。「通常情況下，使用 pH 4.0 的可溶性吡啶可在短時間內有效孵放」（根據不同實驗需要孵放時間以實驗為準）。

7、調節 pH 值：在孵化時間結束后，迅速用梁氏緩沖液或其它可以中和低 pH 的緩沖液調節樣本的 pH 值。

8、孵化對照組：在同樣的溫度下，將一部分病毒樣本用磷酸鹽緩沖液進行孵化，不加低 pH 緩沖液，作為對照組。

9、氧化還原劑處理：可以使用過氧化氫或電子束滅活等方法進一步確認病毒已經被滅活。

10、檢測樣本滅活病毒是否被完全滅活，若滅活未徹底可以修改實驗條件重新實驗（例如，調整孵育時間、低 pH 濃度）。

注意事項

1. 實驗操作時必須穿戴完善的安全護具。

2. 實驗環境須嚴格按照生物安全規定設置，以保證實驗操作過程及結束后的環境安全。

3. 實驗器材必須預先消毒，避免外來物質污染病毒樣本。

4. 在操作過程中，避免采用模糊不清的緩沖液混合物，以免在低 pH 緩沖液中出現沉淀。

5. 整個過程應在大型生物安全實驗室中進行，以確保完成病毒的滅活及外泄風險的降低。

常見問題

1. 如何確定每個實驗的 pH 適宜值? 

一般根據病毒樣本適應的范圍來選擇以及前期的實驗推算；

2. 低 pH 溶液使用的越濃病毒滅活效果越好嗎？

不盡然，低于 5.5 的低 pH 緩沖液對病毒的滅活是一種相對慢速的過程，較高的濃度可能需要過長時間的孵育, 同時還可能使病毒樣本性質遭受破壞，同時也極易在操作的過程中生成沉淀，最終導致實驗失敗。