病毒滅活試驗——納米膜過濾技術

原理

納米膜過濾技術根據分子篩原理，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內，從而達到去除病毒的效果。根據目的蛋白的大小，可以選擇平均孔徑不同的濾膜。

納米膜過濾可以同時滿足病毒去除效果好、目的蛋白質通過性高（回收量、過濾時間）、目的蛋白質不變性的特點，另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒，無論病毒基因組是RNA還是DNA，基本靠孔徑大小來去除病毒，所以是當前最可靠的病毒去除、滅活技術。

與常規過濾不同，該過濾技術采用膜的平均孔徑為納米級別，且專為去除病毒而開發。

材料與儀器

納米膜、預過濾膜

步驟

1、納米膜使用前完整性測試：將納米膜過濾器一端連接氣源，另一端連接排水管，排出納濾膜絲內的液體。將排水出口端封閉，若未觀察到有連續氣泡產生，則納濾膜使用前完整性測試合格。

2、制品的納米膜過濾：將預過濾膜依次過濾注射用水及緩沖液（250 mmol/L甘氨酸，pH 3.93）各 200 mL，1000 mL 樣品加入后分別進行預過濾后再進行納米膜過濾；

當下游出現第1滴納濾樣品時開始計時并稱重，前 15 min，每 1 min 記錄 1 次，之后每 5 min 記錄 1 次至 60 min，每 10 min 記錄 1 次至 120 min，每 30 min 記錄 1 次至濾速降低到開始濾速的 1%，終止過濾。每濾出 10 mL 記為 1 個樣品（放室溫 20 h 后于 -30 ℃ 凍存備用）。

3、稱重法確定濾出液質量：蛋白過濾總量 = 過濾總量W / 過濾面積 × 納濾前蛋白濃度 C。

4、蛋白過濾速度：蛋白過濾速度 = W△t / 過濾面積 / △t × 60 × 納濾前蛋白濃度 C。△t 為相鄰兩個過濾時間的差，W△t 為相鄰兩個過濾時間 t 對應過濾總量的差。各變量所采用的單位為： W（g） 、W△ t（g） 、t（min） 、C（mg/mL）

注意事項

1. 針對不同蛋白樣品選擇不同的濾膜材質。

2. 除病毒壓力通常為 2~3 Bar。壓力過高可能影響病毒去除效果，壓力波動情況下可能會造成病毒穿透。

3. 蛋白質濃度過高易發生積聚阻塞膜從而影響過濾效果。

4. 一般重組蛋白的過濾時間在 6 小時以內，血液制品過濾時間在 12 小時以內。

常見問題

1. 蛋白過濾效果差。

答：樣品蛋白質濃度太低，需要抽濾進行富集；蛋白質濃度過高，發生積聚阻塞膜影響過濾效果，要選擇合適的蛋白濃度。

2. 為什么要進行小試載量試驗？

答：不同蛋白質、不同的除病毒過濾器，蛋白質載量差異較大。蛋白性質決定選擇什么樣的膜材質。

3. 為什么有時候過濾速度非常慢？

答：蛋白質可能產生了氣泡，要先去除氣泡。