慢病毒感染懸浮細胞（濃縮感染）

原理

慢病毒（Lentivirus）載體是以 HIV-1（人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，慢病毒具有更廣的宿主范圍，對于分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。

用途

重組蛋白，抗體生產，基因編輯，功能性研究和移植瘤構建。

材料與儀器

無菌 1 × PBS，293T 細胞，鼠源 CD8+T 細胞，opti-mem 培養基，轉染試劑（Lipofectamine3000 等）, 慢病毒質粒（psPAX2/pMD2.G/載體質粒），細胞培養箱，細胞計數器等。

步驟

（1）293T 細胞轉染（病毒包裝）

Day1：取對數生長期的 293T 細胞按照 10 × 106 的細胞數鋪入 10 cm 的培養皿中，使該細胞于第二天融合度達到 90% 左右。

Day2：在 24 小時之內，觀察 293T 細胞的匯合度在 90% 時，根據轉染試劑說明書向其中加入 DNA-脂質體復合體，制備方法如下：

a）在 500 μl Opti-MEM 無血清培養基中加入轉染試劑，混合均勻并置于室溫 5 分鐘。

b）在 500 μl Opti-MEM 無血清培養基中稀釋 DNA，總質量為 15 μg 按照載體質粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。

c）將稀釋后的 a）和 b）輕輕混勻，常溫靜置 20 分鐘，形成 DNA-脂質體復合體。

Day3：將復合體輕柔的滴加至細胞培養皿中，輕輕搖晃培養皿混勻，放入細胞培養箱中培養。

Day4：收集培養第 48 h 的 293T 細胞病毒上清液，將收集到的病毒上清放置于 4 ℃ 冰箱中。并更換新鮮培養基培養 293T。

Day5：收集培養第 72 h 的 293T 細胞病毒上清液，合并 48 h 的病毒上清液。

（2）濃縮病毒

將合并的病毒上清液取出，待用。將離心機溫度降溫到 4 ℃，600 g，離心 15 分鐘，取上清液經過 0.45 μm 濾頭過濾轉移至新的離心管中。配置病毒濃縮液，病毒濃縮液的配置方法如下：

將濃縮后的病毒放置于 4 ℃ 冰箱搖床，旋轉過夜。

（3）感染 CD8+T 細胞

a）離心濃縮后的病毒：濃縮后的病毒過夜放置，在離心機 4℃ 條件下，10 000 g，離心 2 小時。

b）激活 CD8+T 細胞：通過細胞計數，按 0.3 × 106/孔的細胞數鋪入 96 孔板，每孔加入 300 μl 的 T 細胞培養基 (加入 CD3e/CD28，用于刺激細胞)，激活至第三天感染。

c）在 CD8+T 細胞刺激的第三天將病毒加入細胞中：將離心后的病毒的上清完全去除，用 T 細胞培養基重懸病毒（一個 10 cm 大皿可以感染兩個孔，每孔 200 μl），在其中加入 PolyBrene，終濃度為 7.5 μg/ml。去除 CD8+T 細胞中的大部分培養基，向其中加入重懸好的病毒，并輕柔混勻每孔細胞。

d）封板，2 000 rpm，37 ℃ 離心 90 分鐘，放入培養箱靜置 4 小時。將離心后的細胞放入細胞培養箱中進行培養，2~4 小時后吸棄病毒上清，補加新鮮的 T 細胞培養基。

（4）檢測 CD8+T 細胞感染效率

將感染后第二天的 T 細胞從 96 孔板轉移到 48 孔板中，根據細胞的密度分孔培養，補加新鮮培養基。取感染后 3 天的 CD8+T 細胞若干，根據質粒的標簽，進行流式染色或者 Western blot 效率驗證。

注意事項

1、293T 細胞不能鋪得太稀或者太滿，確保 24 h 內進行轉染，否則產病毒顆粒效率低，導致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 觀察培養基顏色是否為橙紅色，若出現黃色或者金黃，說明 293T 狀態不行，或者鋪板時候細胞太多了。出現該情況不建議再進行感染，放棄本次實驗。

3、收集 72 h 病毒后，可取部分 293T 細胞進行轉染效率驗證。

常見問題

1、293T 細胞鋪得過稀或過多，根據實驗室摸索，按 10-12 × 106 的細胞數鋪入 10 cm 大皿，第二天能達到 90%。

2、感染完后細胞狀態不好應及時換液

3、感染效率極低，可能考慮細胞不易轉染，或者是細胞狀態不好。