逆轉(zhuǎn)錄病毒感染懸浮細(xì)胞（上清感染）
原理
逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus） 來源于可感染人和小鼠細(xì)胞的 Moloney 鼠白血病病毒（Mo-MLV），和慢病毒一樣是一種 RNA 病毒。這類病毒可通過逆轉(zhuǎn)錄成為原病毒，然后整合在宿主的基因組中，隨著細(xì)胞分裂可以穩(wěn)定的遺傳下去。因此。逆轉(zhuǎn)錄病毒適合介導(dǎo)外源基因在宿主細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)。
用途
用于構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系；高效感染免疫系統(tǒng)來源的可分裂型細(xì)胞。
材料與儀器
無菌 1 × PBS，293T 細(xì)胞，鼠源 CD8+T 細(xì)胞，opti-mem 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine3000 等），逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，聚凝胺（Poly brene）， 細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞計(jì)數(shù)器等。
步驟
（1）293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（產(chǎn)病毒，病毒包裝）
Day1：取對數(shù)生長期的 293T 細(xì)胞按照 10 × 106 的細(xì)胞數(shù)鋪入 10 cm 的培養(yǎng)皿中，該細(xì)胞于第二天能長至 90% 即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
Day2：根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別用 opti-mem 培養(yǎng)基孵育質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑若干分鐘后，輕柔混勻，逐滴加入至 293T 細(xì)胞中。
Day4：收集培養(yǎng)第 48 h 的 293T 細(xì)胞病毒上清液，用于感染 T 細(xì)胞（詳情見步驟 2），并更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng) 293T。
Day5：收集培養(yǎng)第 72 h 的 293T 細(xì)胞病毒上清液，用于感染（詳見步驟 2）
（2）感染 CD8+T 細(xì)胞（第一次感染）
以 CD8+T 細(xì)胞為例：
Day3：通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，按 1 × 106/孔的細(xì)胞數(shù)鋪入 48 孔板，每孔加入 1 ml 的 T 細(xì)胞培養(yǎng)基（加入 IL-2 細(xì)胞因子及 OVA 蛋白肽，用于刺激細(xì)胞），激活 CD8+T 細(xì)胞。
Day4：收集 48 h 的病毒上清液并離心（600 g，4 ℃，15 min），離心后，將上清液經(jīng) 0.45 μm 濾器過濾轉(zhuǎn)移至新的離心管中，備用。觀察 CD8+T 細(xì)胞刺激情況，并棄去約 800 μl 培養(yǎng)基。每孔加入 1 ml 離心后的病毒上清液（加入 0.6 μl Poly brene/ml），并輕柔混勻每孔細(xì)胞。封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 2 小時(shí)，放入培養(yǎng)箱靜置 4 小時(shí)。4 小時(shí)后，棄病毒上清 800 μL，加入 T 細(xì)胞培養(yǎng)基 1 ml；封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 5 分鐘；棄上層培養(yǎng)基 800 μL，加入 T 細(xì)胞培養(yǎng)基至 1 ml，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（3）二次感染 CD8+T 細(xì)胞
收集 72 h 的病毒上清液并離心（600 g，4 ℃，5 min），對于 CD8+T 細(xì)胞，棄去 800 μl 培養(yǎng)基，加入 1 ml 離心后的病毒上清液，封板，2 200 rpm，37 ℃ 離心 2 小時(shí)，放入培養(yǎng)箱靜置 4 小時(shí)。具體流程同第一次感染一樣，見步驟（2）。
（4）檢測 CD8+T 細(xì)胞感染效率
取感染后 3 天的 CD8+T 細(xì)胞若干，根據(jù)質(zhì)粒的標(biāo)簽，進(jìn)行流式染色或者 Western blot 效率驗(yàn)證。
注意事項(xiàng)
1、293T 細(xì)胞不能鋪得太稀或者太滿，確保 24 h 內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，否則產(chǎn)病毒顆粒效率低，導(dǎo)致感染效率低。
2、293T 包病毒的第 48 h 觀察培養(yǎng)基顏色是否為橙紅色，若出現(xiàn)黃色或者金黃，說明 293T 狀態(tài)不行，或者鋪板時(shí)候細(xì)胞太多了。出現(xiàn)該情況不建議再進(jìn)行感染，放棄本次實(shí)驗(yàn)。
3、收集 72 h 病毒后，可取部分 293T 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證。
常見問題
1、293T 細(xì)胞鋪得過稀或過多，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室摸索，按 10-12 × 106 的細(xì)胞數(shù)鋪入 10 cm 大皿，第二天能達(dá)到 90%。
2、感染效率低或者沒感染進(jìn)去（排除以上注意事項(xiàng)外，可以考慮濃縮感染）
3、避免轉(zhuǎn)染以及感染過程的無菌操作避免污染。
