秀麗隱桿線蟲中超氧化物歧化酶（SOD）活性測定

原理

SOD 是一種廣泛存在于生物體內的金屬酶，是重要的氧自由基清除劑，能催化超氧化物陰離子發生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。

SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統中具有重要作用。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子（O2-），與 WST-8 反應生成水溶性紫色甲臜；SOD 可清除 O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應液紫色越深，說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

用途

檢測樣品中 SOD 的活性。

材料與儀器

SOD 測定試劑盒、60 mm 平皿

1.5 mL 離心管

步驟

A. 樣品制備

1. 樣品收集

整個方案使用 L4 期線蟲作為參考點。用 1.6 mL 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS, pH 7.0）將每個線蟲生長平板上的 L4 期線蟲洗到 1.5 mL 離心管中。

在 4 ℃ 下，重力沉降 30 min 后，小心地移出并丟棄上清。加入 500 μL 預冷的 PBS，溫和重懸沉淀，然后進一步沉降 15 min。然后，丟棄上清，加入 500 μL 預冷的 PBS，輕柔重懸，根據以下步驟在 200 μL PBS 的離心管中獲得有 20、50、100、200、300、400 和500 個線蟲的群體。

以 100 個線蟲的群體為例：

a. 在顯微鏡下計數 20 μL PBS 中的線蟲，分別進行 3 次獨立試驗，估計整個試管內的線蟲密度。

b. 根據獲得的線蟲數量，計算和調整 PBS 的體積，使最終密度為每 20 μL 9~11 條線蟲。例如，如果數字大于 10，則相應地添加更多 PBS；如果數量小于 10，則進行 10 min沉降，并去除相應量的 PBS 以達到所需的密度。

c. 用移液管將 260 μL PBS 與線蟲轉移到新的 1.5 mL 管中，并輕柔重復重新懸浮沉淀。

d. 在三個獨立試驗中計數 20 μL PBS 中的線蟲數量，中間溫和重復移液，以確認線蟲密度，在管中留下 200 μL。如果線蟲密度與設置不一致，請重復步驟 A1b。

通過相同的方式準備具有其他線蟲樣本。

2. 樣品存儲 

將樣本在 5000 xg 下離心 5 min（4 ℃）。用移液器小心移除上清，將沉淀存放在 -20 ℃（過夜）或 -80 ℃（可保存一周以上）。

3. 樣品均質化

a. 在冰上將離心管中的顆粒進行研磨。

b. 在 4 ℃ 下，5000 xg 離心 5 min。吸出 200 μL 上清液。分裝于四管中，每管 50 μL，用于后續測定。

B. SOD 活性測定

1. 根據 ELISA 試劑盒說明書準備標準品、對照和工作液

a. 每個樣品需要 160 μL WST-8/酶工作液和 20 μL 反應液。根據線蟲樣本數和標準品數量計算總量。對于 WST-8/酶工作液，160 μL 由 151 μL SOD 檢測緩沖液、8 μL WST-8 和 1 μL 酶溶液組成。

b. 將原液 1:40 稀釋至 SOD 檢測緩沖液中（即 1 μL 原溶液至 39 μL 緩沖液），制備反應液。

2. 樣品的測定

a. 在 96 孔板中加入 20 μL 標準品和對照，至少設置 2 個復孔。

b. 在 96 孔板中加入 20 μL 線蟲樣品，至少設置 2 個復孔。值得注意的是，在樣品均質步驟后，每個線蟲樣品都經過處理并分成 4 份，避免樣品的重復冷凍解凍。

c. 用多通道移液器在每個樣品中加入 160 μL WST-8/酶工作液，然后加入 20 μL 反應液。標準品濃度分別為 100、50、10、5、2.5、1.25、0.625 U/mL。

d. 有兩個空白對照。空白對照1 用 SOD 檢測緩沖液替代 20 μL 樣品。空白對照2 用 40 μL SOD 檢測緩沖液代替 20 μL 樣品和 20 μL 反應液。

e. 37 ℃ 孵育 30 min。

f. 用酶標儀讀取 450 nm 處的吸光度（A450）。

3. SOD 活性測定的計算

a. 抑制度（%） = （空白對照1 - 標準品或樣品） / （空白對照1 - 空白對照2）× 100%。用已知 SOD 活性及其抑制作用的標準品建立標準曲線。然后，利用曲線計算樣品的 SOD 活性。

b. 將每個樣本的總蛋白濃度作為內參，以消除樣品間線蟲數量的差異，標準化 SOD 活性表示為實測 SOD 活性與該樣本總蛋白濃度的比值。

下表列出了線蟲體內標準化的 SOD 活性，比值一般在 4.04~4.35 之間，然而 20 和 50 個線蟲/組的數值比一般范圍大得多。因此要保證 SOD 活性測定的可行性和穩定性，至少需要使用 100 個線蟲/組。

4. 數據分析

a. 每個樣本至少檢測 3 個等分，每個等分至少設置 3 個檢測復孔，測定每個復孔線蟲總蛋白（TP）值，并計算每個等分的 TP 均值以表示樣品中的 TP 濃度。計算每個復孔的 SOD 值與 TP 均值的比值，得到樣品中的 SOD 活性。

b. 如果樣品來自不同處理，則將對照組中標準化的 SOD 活性歸一化為 100%（或 1.0）；然后，處理組中的標準化的 SOD 活性轉化為對照組的百分比（POCs）（或對照的倍數變化）；然后，使用樣本中的 POC 值（或 fold-change）計算平均 POC。

注意事項

1. 當從生長平板收集線蟲時，蟲漿中的細菌會對測定造成干擾。因此，不使用離心，而是使用重力沉降進行樣品收集。為了完全去除細菌，輕輕清洗沉淀（即重懸 - 沉降 - 丟棄上清液）幾次。

2. 為了確保可重復性，每個試管中應至少有 100 個線蟲。

3. 來自 100 個線蟲的均質 PBS 溶液的上清液足以用于四個等分試樣，這足以用于包括總蛋白濃度在內的四個生化測定。如果同時進行更多的生化測定，線蟲數量應該增加。