分枝桿菌的培養(yǎng)和鑒定

簡(jiǎn)介

分枝桿菌培養(yǎng)包括改良羅氏培養(yǎng)和液體培養(yǎng)（如 BD MGIT 960 液基培養(yǎng)）。目前，固體羅氏培養(yǎng)法是我國(guó)最常用的實(shí)驗(yàn)室結(jié)核桿菌培養(yǎng)方法，該方法非常具有代表性。

結(jié)核桿菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落形態(tài)清晰可見，其中菌落形態(tài)較典型的樣本可以通過(guò)直接觀察菌落的形態(tài)即可做鑒別，因此固體羅氏培養(yǎng)法常用于臨床疑似結(jié)核病標(biāo)本的分離培養(yǎng)、鑒別、保存菌種及抗結(jié)核藥物敏感性測(cè)定等。而且相較于涂片檢查法，改良羅氏固體培養(yǎng)陽(yáng)性率更高。

原理

在加熱條件下，分枝桿菌細(xì)胞壁中的分枝菌酸可與復(fù)紅染液牢固結(jié)合成復(fù)合物，經(jīng)鹽酸酒精處理后也不會(huì)脫色，因此再加染后分枝桿菌仍然呈現(xiàn)紅色，而背景和其他雜菌中則呈藍(lán)色。

目前，Ziehl-Neelsen 痰涂片鏡檢也是我國(guó)結(jié)核病相關(guān)實(shí)驗(yàn)室使用最為普遍的方法，其操作簡(jiǎn)單快捷，特異性高，實(shí)驗(yàn)成本低。

熒光色素金胺「O」是一種含有自由氨基的金黃色堿性染料，能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光色素，且具有選擇性，其離子帶有陽(yáng)電荷，而結(jié)核桿菌帶有陰電荷，因此金胺「O」能和帶陰電荷的抗酸桿菌結(jié)合而著色，在熒光顯微鏡中的高壓汞燈的紫藍(lán)光照射激發(fā)下，使帶金胺「O」染色的結(jié)核菌發(fā)出很強(qiáng)的桔黃色熒光，檢查時(shí)用高倍鏡即可查見明亮細(xì)菌。 

材料與儀器

4% NaOH 標(biāo)本前處理液、離心試管

羅氏培養(yǎng)基、溫箱

步驟

以痰標(biāo)本為例，培養(yǎng)和鑒定分枝桿菌的步驟如下：

1、挑取約 5 mL 痰液至 50 mL 已標(biāo)記的離心試管中。

2、加入 1~2 倍的 4% NaOH 標(biāo)本前處理液：旋渦振蕩 1~2 min。

3、室溫靜置 15~20 min，勿超過(guò) 20 min。

4、加入無(wú)菌 PBS（PH 6.8）至約 45 mL，蓋緊蓋子。

5、離心 3000 g，15 min，倒掉上清液。

6、添加 1~3 mL PBS（PH 6.8）以中和 PH 至 6.8。

7、取 0.1 mL 接種至 2 支培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)管。

8、標(biāo)本前處理的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以污染率 3~5% 為佳。

9、置于 37 ℃ 溫箱培養(yǎng)。

10、接種后 3 天，7 天各觀察 1 次菌落生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)者，則進(jìn)行分枝桿菌鑒定。此后每周觀察一次，記錄菌落生長(zhǎng)及污染情況。

11、有菌落生長(zhǎng)需進(jìn)行染色確認(rèn)，培養(yǎng)至第 8 周無(wú)菌落生長(zhǎng)則可初步判斷為“分枝桿菌培養(yǎng)陰性”。

12、培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌落生長(zhǎng)后，在生物安全柜中從培養(yǎng)基上挑取少量菌落接種于羅氏培養(yǎng)管，并進(jìn)行直接涂片（可將培養(yǎng)液與 5% 石碳酸溶液在玻片上混合以殺滅分枝桿菌），涂片用紫外線照射 1 h 后方可從生物安全柜中取出。對(duì)涂片進(jìn)行熒光金胺 O 染色；

13、熒光金胺 O 染色陽(yáng)性應(yīng)進(jìn)行萋尼氏抗酸染色進(jìn)一步確認(rèn)；

14、萋尼氏抗酸染色陽(yáng)性則使用培養(yǎng)液進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌抗原金標(biāo)法檢測(cè)；

15、此外也可通過(guò) DNA 測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。其操作流程可分為基因組提取 - PCR 擴(kuò)增 - Sanger 測(cè)序（具體流程參見 DNA 測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程）。

注意事項(xiàng)

1. 可適當(dāng)調(diào)整 NaOH 的濃度從而調(diào)整污染率。

2. 標(biāo)本前處理液請(qǐng)?jiān)?24 h 內(nèi)使用。