最小抑菌濃度（MIC）測定——微量稀釋法

簡介

最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration， MIC）是指能夠抑制微生物生長、繁殖的最低藥物濃度。MIC 測試方法有很多種，常見的測試方法有如下三種：微量稀釋法、瓊脂稀釋法、E-test 法。本次詳細介紹微量稀釋法。

原理

將抗菌藥物與待測微生物在一定的稀釋范圍內(nèi)進行培養(yǎng)，通常是在每毫升（mL）100 萬個菌落形成單位（CFU）的懸浮濃度時，測定抗菌藥物不同濃度下微生物的生長情況。由于微生物的存在，沒有抗菌活性的測試體系會出現(xiàn)渾濁，而沒有渾濁則表明待測微生物的生長受到了抑制。

用途

測定藥物的最小抑菌濃度，評價藥物的抗菌活性及抑菌能力。

材料與儀器

滅菌陽離子調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 Mueller-Hinton Broth（CAMHB）

待測藥物粉劑、待測菌株、滅菌生理鹽水

滅菌雙蒸水、固體培養(yǎng)基

無菌 V 型 / U 型底 96 孔培養(yǎng)板

麥氏濁度儀、滅菌塑料比濁試管

多道移液器

步驟

1. 提前將待測菌株接種于相應固體培養(yǎng)平板上，于 37 ℃ 細菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

2. 分別稱取適量待測抗菌藥物粉劑，加滅菌雙蒸水充分溶解，配制成貯存液備用。

3. 按實驗需求，使用 CAMHB 液體培養(yǎng)基稀釋貯存液至最高待測藥物濃度，取無菌 96 孔板，在生物安全柜中進行藥物稀釋，具體操作為：

第一孔（A1）加入 200 μL 最高待測濃度藥物，A2~A12 孔加入 100 μL CAMHB 液體培養(yǎng)基，隨后從 A1 孔吸出 100 μL 加入 A2 孔，混勻后再從 A2 孔吸出 100 μL 加入 A3 孔，以此類推梯度稀釋到 A12 孔，并舍棄最后 100 μL 稀釋后的液體。

4. 在透明塑料試管中加入 1 mL 滅菌生理鹽水；置于濁度儀上調(diào)零，隨后挑取待測菌株充分溶于生理鹽水，震蕩混勻，調(diào)整濁度于 0.4～0.6 麥氏濁度（MCF）之間，繼續(xù)用滅菌生理鹽水稀釋 20 倍備用。

5. 將 10 μL 稀釋后的菌懸液依次加入每個濃度的藥物孔（A1~A12）中；將 96 孔板置于 37 ℃ 細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16~18 h。

6. 讀取沒有細菌生長的最低藥物濃度，即為該細菌對該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

7. 藥敏試驗以大腸埃希菌 ATCC25922 等標準菌株作為質(zhì)控菌株，藥敏判斷標準參照 CLSI、EUCAST 指南。

注意事項

1. 每次實驗時應根據(jù)待測菌的不同而分別選用：金黃色葡萄球菌 ATCC25923、大腸埃希菌 ATCC25922、糞腸球菌 ATCC29212 和銅綠假單胞菌 ATCC27853 等標準菌株在同一試驗條件下作平行試驗，常用抗菌藥物對這些標準菌株的 MIC 應在預期值范圍內(nèi)。

表 1 質(zhì)控菌株 MIC 范圍 （mg/L）

2. 培養(yǎng)基要求是適合微生物生長，有些微生物對培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求，要用特殊的培養(yǎng)基才能進行藥敏試驗：例如，流感嗜血桿菌的藥敏試驗培養(yǎng)基用 HTM 瓊脂；淋球菌的藥敏試驗培養(yǎng)基用加 5% 羊血的巧克力 MH 瓊脂；肺炎鏈球菌的藥敏試驗用 MH 加 5% 的脫纖維羊血培養(yǎng)基。

3. 不同抗生素的穩(wěn)定性不同，抗生素貯存液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，或低溫保存，若出現(xiàn)明顯的狀態(tài)變化，應重新配置。

4. 某些特殊藥物需要根據(jù)藥物性質(zhì)預處理培養(yǎng)基以消除拮抗成分；如頭孢地爾的藥敏試驗使用去除鐵離子的 CAMHB。

常見問題

質(zhì)控組的 MIC 不在預期范圍內(nèi)稱為失控，常見的影響 MIC 測定結果的因素如下：

（1）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的 pH、滲透壓及電解質(zhì)對 MIC 有影響；　　

（2）抗菌藥物：抗菌藥物必須采用標準粉劑。配好的藥物原液應在有效期內(nèi)使用；　　

（3）結果觀察時間：大部分微生物在 12～18 h 觀察，有的病原微生物在 20～24 h 觀察。培養(yǎng)時間過長，被輕度抑制的部分病原菌可重新開始生長；另外由于某些抗菌藥物不夠穩(wěn)定，培養(yǎng)時間過長使其抗菌活性降低，甚至消失，從而使 MIC 值增高。