病毒 的分離和鑒定

簡介

不同的病毒分離時采用不同的分離方法，這主要取決于目的病毒的生物學(xué)特性。常用的病毒分離方法有細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚接種法、動物接種法，而對細(xì)胞、雞胚不敏感，又沒有合適動物模型的病毒，可采用基因克隆的方法。

材料與儀器

器材：
①一次性無菌手套
②標(biāo)本采集管
③棉簽拭子
④電子顯微鏡
⑤微孔板條
⑥酶標(biāo)儀
⑦PCR儀

試劑：
①材料：待采標(biāo)本
②PBS緩沖液
③瓊脂

步驟

病毒分離和鑒定根據(jù)病毒種類不同，其基本步驟可分為如下幾種：

（一）痘病毒

1．用12日齡雞胚做致死試驗來鑒別天花病毒的不同型別。將痘苗病毒鼻內(nèi)接種給乳鼠可導(dǎo)致致死性肺炎，有些痘苗病毒株皮內(nèi)注射可引起2日齡的家兔死亡，故可用乳鼠和乳兔鑒別不同毒株，也可以測定用于生產(chǎn)疫苗的痘種毒力。兔和小鼠是猴痘病毒的易感實驗動物。

2．雞胚絨毛尿囊膜（CAM）法可用于正痘病毒的分離，副痘病毒和雅塔病毒不能用雞胚絨毛尿囊膜法分離。

（1）分離天花和猴痘病毒時，將待分離標(biāo)本（血液、唾液、涂片、水皰液、膿皰液和痂皮）制成懸液，接種于受精雞胚（38～39 ℃孵育11～13天）絨毛尿囊膜上。

（2）將接種后的雞胚置35 ℃，孵育72小時。

（3）在培養(yǎng)過程的觀察中，記錄雞胚上膿皰出現(xiàn)的時間、形態(tài)、大小以及病灶顏色。此法可鑒別天花和猴痘病毒。天花病毒在CAM上形成直徑為1 mm光滑圓蓋狀的痘斑，顏色呈灰白色或乳白色，無出血。放大10倍觀察有一暈圈繞在不透明的中心周圍，呈煎荷包蛋狀；猴痘病毒在CAM上形成的痘斑直徑1 mm左右，痘斑呈扁平而周圍隆起，有些痘斑中心似火山口，有些痘斑出血，紅細(xì)胞聚集在中心區(qū)。

3．細(xì)胞培養(yǎng)：多數(shù)人和靈長類動物細(xì)胞均可用于天花、猴痘等正痘病毒的培養(yǎng)。常規(guī)使用人胚肺、嬰兒包皮二倍體細(xì)胞、原代恒河猴腎細(xì)胞、Vero細(xì)胞等。猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒接種細(xì)胞后，1～3天內(nèi)感染細(xì)胞發(fā)生融合脫落，形成直徑2～6 mm的空斑。天花病毒感染的細(xì)胞1～3天內(nèi)形成多核融合細(xì)胞，并有細(xì)胞增生團，脫落空斑較小，直徑1～3 mm。據(jù)此，猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒可與天花鑒別。另外，在單層細(xì)胞上，天花病毒產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）而猴痘病毒不產(chǎn)生CPE。

（二）皰疹病毒

1．動物試驗：將HSV接種家兔角膜，很容易引起家兔的角膜炎，并在家兔體內(nèi)建立病毒的三叉神經(jīng)節(jié)的潛伏感染，因此家兔是最常用的HSV角膜炎模型。另外也常用豚鼠作為HSV的生殖器感染模型。

2．細(xì)胞培養(yǎng)

（1）敏感細(xì)胞：多種動物細(xì)胞對皰疹病毒易感，可用于進(jìn)行培養(yǎng)分離。原代兔腎、豚鼠胚成纖維細(xì)胞、人胚細(xì)胞（腎或肺）對單純皰疹病毒最敏感，人肺二倍體MRC-5和WI-38細(xì)胞株對病毒也相當(dāng)敏感，其他如傳代細(xì)胞HeLa、Hep-2、A549，猴腎傳代細(xì)胞如Vero、MA104等細(xì)胞也可用于病毒的分離培養(yǎng)，但敏感性不如人原代細(xì)胞和二倍體成纖維細(xì)胞。

人胚肺原代成纖維細(xì)胞、WI-38、MRC-5可用于VZV的分離培養(yǎng)；EB病毒的體外培養(yǎng)比較困難，一般用血清學(xué)方法進(jìn)行輔助診斷，如需培養(yǎng)，應(yīng)將咽漱液、唾液等標(biāo)本直接接種到人臍帶血淋巴細(xì)胞中，培養(yǎng)時間為4周；HCMV對宿主或組織培養(yǎng)細(xì)胞有明顯的種屬特異性要求，只有在同種的動物成纖維細(xì)胞中才能增殖，且培養(yǎng)分離方法是檢測巨細(xì)胞病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，所有一切新的檢測技術(shù)均需要與此方法比較，才能獲得正確的評價。

（2）細(xì)胞病變：HSV引起的細(xì)胞病變（CPE）的特點是，感染細(xì)胞腫大、變圓，折光性強，有的分離株會導(dǎo)致細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞，CPE出現(xiàn)快而明顯。含有高濃度病毒的標(biāo)本，可在接種后18～24小時出現(xiàn)CPE，病毒含量低的標(biāo)本則需要4～5天才能觀察到CPE。

如果在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加地塞米松，可加快CPE的出現(xiàn)或者增加CPE病灶的數(shù)量。區(qū)別單純皰疹病毒1型和2型的方法有4種：

①HSV-1不在雞胚成纖維細(xì)胞形成空斑，而HSV-2常在此細(xì)胞形成空斑；②HSV-1對溴乙烯尿苷（BVDU）相當(dāng)敏感，而HSV-2則對BVDU相對抵抗；③型特異性單克隆抗體分型；④DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析。

與HSV相比，VZV的復(fù)制周期長、繁殖緩慢，CPE通常在接種后3～14天才出現(xiàn)。病毒在感染細(xì)胞中的病灶開始局限，發(fā)展十分緩慢。病灶內(nèi)的病變細(xì)胞腫脹變圓，出現(xiàn)核內(nèi)嗜酸性包涵體，形成多核巨細(xì)胞。病毒可通過細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行擴散而感染鄰近細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液中含有很少的感染性病毒。

HCMV在細(xì)胞培養(yǎng)中，CPE出現(xiàn)一般較慢，短者數(shù)天，長者可達(dá)數(shù)周，一般7～12天。特點是細(xì)胞膨脹，核變大，形成巨大的細(xì)胞，有折光性的細(xì)胞質(zhì)顆粒和核內(nèi)包涵體。病毒感染早期病毒與細(xì)胞緊密結(jié)合，病毒感染可在細(xì)胞之間傳播，并逐步擴展至鄰近細(xì)胞，病變細(xì)胞相互連接，形成感染灶。病灶中最先出現(xiàn)的病變細(xì)胞逐漸退化脫落，最后病變擴散到整個單層細(xì)胞。

（三）人乳頭瘤病毒

有些情況下，病毒能夠在細(xì)胞中發(fā)生流產(chǎn)感染。用跖疣的人乳頭瘤病毒感染胎兔腎細(xì)胞或人胚肺成纖維細(xì)胞，可短暫刺激病毒DNA合成，但無細(xì)胞病變產(chǎn)生；在感染后的人成纖維細(xì)胞里可測出低水平的病毒DNA序列。