皮膚和黏膜感染標本直接檢測病毒

簡介

直接檢測病毒的方法包括電鏡觀察病毒顆粒、光鏡下觀察病毒感染后宿主細胞的特殊改變、免疫熒光檢測、酶免疫技術以及病毒核酸檢測技術等。

材料與儀器

器材：
①一次性無菌手套
②標本采集管
③棉簽拭子
④電子顯微鏡
⑤微孔板條
⑥酶標儀
⑦PCR儀

試劑：
①材料：待采標本
②PBS緩沖液
③瓊脂

步驟

皮膚和黏膜感染病毒標本直接檢測病毒的基本步驟可分為如下幾種：

（一）直接檢測病毒顆粒

1．痘病毒，電鏡檢查是診斷所有痘病毒感染的最可靠、最快速的方法。用磷酸鹽緩沖液（PBS）將采集的水皰或膿皰制成懸液，痂皮或活檢組織用PBS研磨制成懸液，滴于載網上，經負染后用電鏡觀察。

電鏡觀察不能區別天花、猴痘、痘苗和牛痘病毒，但能夠鑒別水痘-帶狀皰疹病毒與痘病毒（天花或猴痘）感染。患者病損基底部涂片的吉姆薩染色法，在光學顯微鏡下可對天花病毒進行快速診斷。在活動期病損部位有大量的病毒，可作出準確的診斷，但出疹以前的潛伏期幾乎不能檢出天花病毒。

2．皰疹病毒，取皰疹液直接進行電子顯微鏡負染色檢測可迅速確診皰疹病毒感染，電子顯微鏡下的HSV顆粒多有包膜，病毒形態比較典型。

（二）直接檢測病毒抗原

1．天花病毒 用瓊脂凝膠沉淀試驗、補體結合試驗、免疫熒光試驗可檢測天花病毒抗原。與電鏡相比，這些檢測技術的結果常不可靠，偶用酶聯免疫吸附試驗和放射免疫試驗，但不列為常規。

2．皰疹病毒

（1）單純皰疹病毒：

如有宮頸脫落細胞、角膜細胞、腦活檢組織或皮膚黏膜病損灶，可用于病毒抗原檢測，常用的方法有免疫熒光法或免疫酶法。第一抗體為特異性的HSV多克隆抗體或型特異性的單克隆抗體，如使用單克隆抗體，固定組織或細胞的最好為乙醇或甲醇，而不宜使用丙酮。

（2）水痘-帶狀皰疹病毒：

由于臨床表現典型，一般不做實驗室檢測，對不典型的或臨床特殊病例需做病原學診斷的，可取皰疹病損部位的涂片、皮膚刮取物、水皰液、活檢組織等采用免疫組化、免疫熒光法、免疫酶法進行檢測。痂皮和皰疹拭子、活檢組織可用于檢測VZV特異性抗原（如gE蛋白、ICP4等）和核酸。

（3）人巨細胞病毒：由于HCMV在細胞培養中出現CPE時間較長，因此，近年來用抗人巨細胞病毒早期抗原的單克隆抗體，通過間接免疫熒光和免疫酶技術檢測接種臨床標本（白細胞、活檢組織、組織切片、支氣管肺泡洗液等）的組織細胞培養物中的病毒早期抗原，其中包括IEA、EA、LA和pp65等。

與常規細胞培養相比，敏感性達93％ ，特異性達94.4％ ，可在接種標本后24小時內檢出病毒。應用免疫組化法可檢測病變組織中病毒抗原，也是分析各種器官中HCMV播散的有用工具，本法也可用于病毒抗原血癥的定量檢測。

其定量測定法是指10個外周血多形核白細胞中IEA、EA陽性細胞數，并將＜10、10～50、＞50個IEA、EA陽性細胞數定為低、中、高抗原血癥水平。本法亦可用于免疫缺陷病患者的HCMV感染的早期快速診斷，并可作為監視疾病活動性和指導臨床治療及觀察療效的指標。

（4）EB病毒：在大多數相關病變組織中有存在病毒的核蛋白和膜蛋白，可用免疫熒光法檢測。

（三）直接檢測病毒抗體

病毒抗體檢測是檢測皰疹病毒感染，特別是對確定某些原發、急性或活動性病毒感染，篩選血、器官供體，均需做血清學檢測。

1．單純皰疹病毒 目前診斷HSV感染的免疫學方法有補體結合試驗（CF）、中和試驗（NT）、免疫熒光試驗（IFA）、ELISA和放射免疫試驗（RIA）等。臨床常用ELISA法檢測抗HSV-IgM類抗體，并有商品試劑盒供應。

以ELISA檢測抗HSV-IgM類抗體為例介紹：

①在孔架中放入合適數量微孔板條。
②血清標本，陽性、陰性對照和校正液用標本稀釋液作1：40稀釋，混勻后分別加至微孔中，100 μl／孔，以稀釋液做空白，室溫30分鐘。
③棄孔內液體，用洗滌液洗3次。每孔加入100 μl酶標記抗體液，室溫30分鐘。用洗滌液洗滌3次。
④每孔加入100 ul TMB-H2O2液，室溫30分鐘呈色。
⑤每孔加入100 μl 12 mol／L HCl溶液終止反應，酶標儀450 nm波長讀吸光度（A）值。

2．人巨細胞病毒 HCMV血清學檢測的特異性抗體有IgG和IgM等，可取患者雙份血清檢測IgG抗體，抗體效價或滴度如有4倍或以上增長可臨床診斷；取單份血清檢測IgM抗體，如陽性說明患者近期感染HCMV或發生活動性HCMV感染；近年來國內外也有檢測人巨細胞病毒IgA抗體作為診斷活動性人巨細胞病毒感染的指標。同時檢測人巨細胞病毒IgM和IgA，其陽性率明顯高于單純檢測人巨細胞病毒IgM。

由于檢測HCMV IgM可受類風濕因子與IgG競爭抗原的干擾，在檢測標本時應對血清預處理以去除IgG抗體，避免血清反復凍融，才能提高IgM的檢測率。

3．EB病毒 在增殖性感染過程中產生多種抗原，如病毒早期抗原（VEA）、病毒衣殼抗原（VCA）、病毒核抗原（VNA）、病毒膜抗原（VMA）等，并誘導產生多種針對不同抗原的抗體，各種抗體出現的時間和意義有所不同。

VCA-IgG抗體在病毒感染早期即存在，并長期存在，而效價的動態改變不明顯，一般用于流行病學調查；VCA-IgM抗體出現，隨之出現的抗NA抗體效價的逐步增高提示原發性感染；VCA-IgA或EA-IgA抗體滴度≥1：5～1：10或滴度持續升高，對鼻咽癌有輔助診斷意義。許多鼻咽癌患者發病鼻咽黏膜惡變早期即可測出上述抗體，經治療好轉后上述抗體的效價也逐漸降低。

（四）直接檢測病毒核酸

1．皰疹病毒檢測 單純皰疹病毒DNA可用PCR或原位核酸雜交法，對病毒感染進行早期、快速診斷，不僅可使檢測時間大大縮短，為臨床治療提供了有利時機，而且其敏感性和特異性非常高。

原位雜交檢測核酸技術不僅可以直接檢測出甲醛固定的石蠟包埋組織切片中的皰疹病毒，并可用于多種患者活動性皰疹病毒感染的診斷。目前采用PCR技術可快速診斷皰疹病損組織或其他多種組織中的病毒DNA，如快速檢測病毒性腦炎患者腦脊液中的HSV DNA，檢測先天性HCMV感染或免疫抑制患者活動性HCMV感染以及鼻咽癌組織中的EB病毒DNA等。

其陽性檢出率明顯高于細胞培養法。但一般PCR法都是定性診斷，其檢出不一定與病毒血癥和臨床癥狀相一致，近年來使用的定量PCR，可定量檢測出皰疹病毒的實際水平，與病毒血癥和臨床癥狀相一致，且病毒DNA血癥出現時間比病毒血癥、抗原血癥出現時間更早，為進一步監測病毒活動性感染和判斷病毒治療療效提供了可靠依據。

常用的檢測HSV-1或HSV-2型糖蛋白基因gB的特異性引物如下：5＇引物：5＇-GCATCGTCGAGGAGGTGGAC-3＇；3＇引物：5＇-TTGAAGCGGTCGGCGGCGTA-3＇。該引物不能 擴增VZV、HCMV DNA，其PCR產物大小為149bp。

產物的特異性鑒定可用Southern印跡法，雜交用gB探針序列為5＇-GGCGACTTTGTGTACATGTCCCCGTTTTACGCGTACCGG-3＇。限制 性內切酶Bstl消化PCR產物可區分 HSV-1（有切點85＋64bp）與HSV-2（無切點）。

2．人乳頭瘤病毒 由于目前尚未建立可靠的血清學方法，檢測病毒DNA是用于診斷人乳頭瘤病毒的主要方法，可以用核酸雜交或PCR的方法。

（1）核酸雜交：人乳頭瘤病毒分型及感染診斷采用DNA-DNA分子雜交法。從懷疑為人乳頭瘤病毒感染的病變組織中提取DNA，與標記的人乳頭瘤病毒DNA探針進行斑點雜交、Southern印跡或原位雜交。該法敏感，如探針為型特異性，即可檢測出相應的人乳頭瘤病毒型別。點雜交簡便、易行；Southern印跡可靠，易于分型；原位雜交可以在細胞內定位。

（2）PCR：PCR技術用于人乳頭瘤病毒感染診斷，具有方便、快速、特異、敏感的特點，極有應用價值。可根據不同病毒型別的特異保守區，分別設計各個型別的引物，進行PCR擴增，直接確定不同型別的人乳頭瘤病毒感染。

也可根據病毒所有型別的共同保守區設計通用型引物，將這一對引物經PCR擴增后，就可檢出所有型別的人乳頭瘤病毒感染。如果需要分型，再將陽性病例用型特異性的引物作PCR，或用型特異性的寡核苷酸探針作點雜交或Southern印跡，以確定感染的型別。