腹瀉病毒的分離與鑒定

簡介

病毒分離雖然在某些情況下可以成功使用，但并非檢測腹瀉病毒的常規(guī)方法。因為，任何一種人杯狀病毒在細胞培養(yǎng)中都無法生長，而且其他的腹瀉病毒也對生長條件比較挑剔。

有幾種不同的細胞系（例如：MA104，CaCo-2，原代猴腎細胞）可用于糞便標本中A組輪狀病毒的分離，但是成功的分離通常需要經(jīng)過一系列的復(fù)雜過程。相對于糞便標本，用直腸拭子進行病毒分離不太可能產(chǎn)生陽性的培養(yǎng)結(jié)果。

已有不同的方法用于腹瀉病毒的檢測和分型。這些方法可以直接對臨床標本進行檢測；使用細胞系從臨床標本中分離出病毒時，相同的方法也適用于病毒分離物的檢測。現(xiàn)有抗原分型和基因分型兩種方法對病毒進行鑒定，對于那些能在細胞培養(yǎng)基中生長的病毒，可以使用型特異性抗血清以交叉中和試驗的反應(yīng)性結(jié)果來判斷血清型。

材料與儀器

器材：
①一次性無菌手套
②培養(yǎng)箱、離心機

試劑：
①培養(yǎng)基
②抗生素

步驟

腹瀉病毒的分離與鑒定根據(jù)病毒種類不同具體如下：

1．病毒分離

（1）腸道腺病毒（腺病毒40型和41型）首先在Chang氏結(jié)膜細胞（Chang conjunctival cells）中被分離出來，然而現(xiàn)在許多病毒學(xué)家使用Graham293細胞分離這些病毒。這些病毒在細胞培養(yǎng)中通常很少或者不引起細胞病變效應(yīng)，比其他人腺病毒更難分離。

（2）星狀病毒可以在不同的細胞系中進行培養(yǎng)，以來源于人小腸組織的細胞系（CaCo-2、T84細胞）最為敏感。可以用載玻片培養(yǎng)法（shell vial assay）快速檢測出陽性的培養(yǎng)物。該方法是在孵育18小時后，用免疫熒光法在培養(yǎng)細胞中檢測病毒抗原。使用細胞對病毒進行分離擴增之后再用RT-PCR技術(shù)檢測，是另一種用于識別星狀病毒的方法。

2．病毒的鑒定

（1）輪狀病毒的鑒定：A組輪狀病毒可以分為G血清型（根據(jù)糖蛋白VP7劃分）和P血清型（根據(jù)對蛋白酶敏感的VP4劃分）。已經(jīng)開發(fā)出了檢測G和P血清型的單克隆抗體，但是單克隆抗體還沒有在臨床實驗室中廣泛應(yīng)用。

臨床實驗室應(yīng)用廣泛的是基于RT-PCR的檢測方法，這種方法采用型特異性引物可以進行基因分型分析。由于新毒株的不斷出現(xiàn)或者引物設(shè)計區(qū)域發(fā)生核苷酸點突變，PCR方法有時不能對病毒株進行基因分型或者導(dǎo)致錯誤分型。根據(jù)對11個基因片段逐個進行核苷酸序列分析，已經(jīng)開發(fā)出了一個完整的基因分型系統(tǒng)用于病毒株的分類，這種方法可以檢出輪狀病毒重組株和新出現(xiàn)的病毒株。

（2）杯狀病毒的鑒定：由于在體外無法培養(yǎng)人杯狀病毒，因此很難建立杯狀病毒血清型分型方法。使用固相免疫電鏡（solid-phase immune electron microscopy，SPIEM）檢測人恢復(fù)期血清標本中的諾如病毒，可以對諾如病毒進行抗原分型，但是由于這些檢測缺少標準試劑，這項技術(shù)在大多數(shù)實驗室并不實用。

分子生物學(xué)方法可以將諾如病毒和札如病毒分成若干基因組和基因型，基因組和基因型的確定是根據(jù)全長VP1區(qū)的核苷酸序列的差異，但是較短的基因組序列也可用來推測基因型。雖然可利用聚合酶基因的核苷酸序列差異來對諾如病毒進行基因分型，但當病毒發(fā)生重組時會導(dǎo)致錯誤的基因分型。

因此，同時獲得聚合酶和衣殼的核苷酸序列，不僅可以確定基因分型，還能識別重組的病毒株。基因組特異的RT-PCR技術(shù)也可以用來檢測病毒的基因組，當擴增產(chǎn)物無法測序時可以用雜交方法推測基因型。對札如病毒進行分類的檢測方法目前還很少，曾有報道關(guān)于基因組特異性的RT-PCR技術(shù)對札如病毒進行分類。

（3）腸道腺病毒的鑒定：腸道腺病毒可以按照其抗原性分類或者按照基因型分類。人腺病毒可以根據(jù)它們凝集大鼠和猴紅細胞的能力進行分類，腸腺病毒F組與C組和E組的特性相同，可以部分地凝集大鼠紅細胞。

在六鄰體（hexon）蛋白和纖毛（fiber）蛋白上還發(fā)現(xiàn)了組和型特異性的抗原決定簇，而且識別這些抗原決定簇的單克隆抗體可以用于腺病毒分類。腸道腺病毒的基因分型還可以通過斑點雜交法、基因組DNA的限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）或者型特異性的PCR法鑒定。

（4）星狀病毒的鑒定：用型特異性抗血清可將星狀病毒分成不同的血清型，這種檢測可以通過ELISA法進行。除此之外，星狀病毒還可以用分子生物學(xué)方法進行分類。

對于鑒定對應(yīng)于血清型的基因型，通過對RT-PCR擴增后的產(chǎn)物進行核苷酸序列分析來確定，這種方法中使用的引物需能夠擴增所有星狀病毒株；基因型還可以使用型特異性引物的RT-PCR技術(shù)，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的大小來確定，這種方法中使用的引物根據(jù)不同基因型病毒擴增后產(chǎn)生不同大小的擴增片段來確定。