腸道感染病毒標本的采集與處理
簡介
胃腸道病毒（enterovirus，EV）首先在人腸道中復制，但很少引起胃腸道癥狀，臨床表現主要為以消化道為原發灶的全身感染。EV感染以隱性感染多見，嬰幼兒、免疫力低下的成人易感。盡管同一種EV可引起不同臨床表現，而不同EV也可引起相同癥狀。
但通常來說，特有的臨床表現常與特定的腸道病毒感染相關聯。例如，急性出血性結膜炎（acute hemorrhagic conjunctivitis，AHC）通常是由柯薩奇病毒A24變種（CV-A24v）或腸道病毒70（EV-D70）引起；急性弛緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）通常是由脊髓灰質炎病毒和腸道病毒71（EV-A71）引起。
胃腸道病毒標本采集用于EV核酸檢測、病毒分離鑒定的標本主要為患者的糞便、咽拭子和皰疹液等臨床標本，如患者出現神經系統癥狀，則應采集腦脊液標本。
急性出血性結膜炎患者應采集結膜拭子或結膜刮取物標本。血清學診斷時，需要采集患者急性期和恢復期的雙份血清標本。
材料與儀器
器材：
①一次性無菌手套
②采集管
試劑：
①材料：采集標本
②標本緩沖液
步驟
腸道感染病毒標本的采集與處理根據樣本類型，其基本過程可分為如下幾種：
一、腸道感染病毒標本的采集
（1）糞便標本：采集患者發病7日內的糞便標本。糞便標本采集量為5～8 g／份，采集后應立即放入無菌采便管內，4 ℃保存，立即（24小時內）送達實驗室，需長期保存的標本應存于-70 ℃冰箱中。
（2）咽拭子標本：采集患者發病3日內的咽拭子標本。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5ml保存液的保存管中，保存液配方為91.5 ml Eagle＇s MEM 中加入青霉素和鏈霉素（終濃度為：青霉素100 U／ml，鏈霉素為100 μg／ml）、胎牛血清（終濃度為2％ ）、3.5 ml 7.5％ NaHCO3、1 mlL-谷氨酰胺溶液、1 ml 1 mol／L的HEPES溶液。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防標本干燥。4 ℃保存，立即（12小時內）送達實驗室，-20 ℃以下低溫冷凍保存，需長期保存的標本應存于-70 ℃冰箱中。
（3）血清標本：采集急性期血清（發病0～7天）檢測相應EV-IgM抗體可用于早期臨床診斷，采集急性期（發病0～7天）和恢復期（發病14～30天）雙份配對血清檢測IgG或中和抗體，可用于回顧性診斷。靜脈采集3～5 ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于-20 ℃以下冰箱中冷凍保存。
（4）皰疹液：采集急性期皰疹液時，應先用75％的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破，用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3～5 ml病毒保存液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4 ℃保存，立即（12小時內）送達實驗室，-20 ℃以下低溫冷凍保存，需長期保存的標本應存于-70 ℃冰箱中。
（5）腦脊液標本：腦脊液可用于抗體檢測、核酸檢測或病毒分離。出現神經系統癥狀的病例，應采集腦脊液標本；采集時間為出現神經系統癥狀后3天內，采集量為1.0～2.0 ml。標本采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4 ℃保存，立即（12小時內）送達實驗室，需長期保存的標本應存于-80 ℃冰箱中。
（6）患者眼結膜拭子或結膜刮取物標本：對于急性出血性結膜炎患者，患者眼結膜拭子或結膜刮取物是核酸檢測或病毒分離CV-A24v、EV-D70的主要標本。標本應在起病1～3天內采集。用滅菌棉拭子涂擦翻轉的上、下瞼結膜并拭取淚液后，應立即投入裝有病毒保存液標本采集管中，貼好標簽，置冰壺內攜至實驗室或低溫（-70 ℃以下）凍存。
二、腸道感染病毒標本的處理
（1）糞便標本：由于糞便標本成分較為復雜，含有的細菌、真菌、毒素等成分可干擾后續的EV病毒分離培養以及EV核酸直接檢測。糞便標本應事先用三氯甲烷進行處理，然后用于EV的病原學檢測。三氯甲烷處理過程可滅活有包膜的微生物（細菌、真菌、含包膜病毒等），以及大部分脂溶性毒素，并充分分散聚集成團的EV。
操作過程及步驟：
①在生物安全柜中，取約2 g糞便標本、10 ml含有抗生素的完全PBS（含鈣、鎂離子的磷酸緩沖液）、1 ml三氯甲烷加入50 ml耐三氯甲烷的離心管中。②使用機械振蕩器劇烈振蕩20分鐘，制成糞便懸液。③使用低溫挎籃式離心機（bucket centrifuger），4 ℃條件下，1500 g離心力，水平離心20分鐘。離心后，包含有脂溶性毒素以及有包膜微生物的三氯甲烷位于底層，EV則位于上層的PBS中。④在生物安全柜中將含有EV的上清轉移至無菌的外螺旋凍存管中，以備后續檢測。
肛拭子的處理可參考糞便。
（2）咽拭子標本：咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動，洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的細胞等。然后，在4 ℃條件下，10000 r／min離心20分鐘，上清用于后續病原學檢測。病毒分離培養過程中，如果接種細胞后發現有細菌污染，則應使用0.45 μm無菌濾器對原始標本進行過濾以去除細菌。其他呼吸道標本處理可參考咽拭子。
（3）其他標本：腦脊液、皰疹液、心包液標本4 ℃條件下離心去除雜質和細菌后，可直接用于后續檢測。結膜拭子的處理可參考咽拭子。
注意事項
（1）用于采集的咽拭子標本必須置于適當的病毒保存液中，以防病毒干燥和滅活。
（2）用于核酸檢測和病毒分離的標本，應在患者發病后盡早采集，盡快檢測；不能立即檢測的標本應冷凍保存。
（3）對用于血清學診斷的急性期血清應該在患者發病后盡早采集，恢復期血清則應在患者發病2周后采集。
（4）臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融，如果不能確保-20 ℃的條件，應該在0～8 ℃運輸和保存。
（5）標本運輸時要附有必要的信息，如標本編號、患者發病日期和標本采集日期。
