腸道感染病毒的分離鑒定

簡介

病毒分離是分子檢測(cè)技術(shù)發(fā)明之前，用于EV檢測(cè)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。大多數(shù)EV病毒可在多種人源或靈長類動(dòng)物來源細(xì)胞系上進(jìn)行增殖。但由于每種細(xì)胞系對(duì)不同EV的敏感性不同，沒有任何一種細(xì)胞系可以用于分離所有型別的EV。

一般通過增加使用具有不同分離譜的細(xì)胞系種類，來增加分離EV的敏感性。最為常用的細(xì)胞系有：人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系（rhabdomyosarcoma，RD）、人喉癌上皮細(xì)胞系（human laryngeal epidermoid carcinoma，Hep-2）、 非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）等。

轉(zhuǎn)基因表達(dá)人CD155的鼠源細(xì)胞系（L20B）可用于PV的篩選。某些型別的EV不易在細(xì)胞系上增殖（如柯薩奇病毒A組部分型別），可在乳鼠上進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

材料與儀器

器材：
①一次性無菌手套
②標(biāo)本采集管
③棉簽拭子
④培養(yǎng)箱

試劑：
①材料：待采標(biāo)本
②PBS緩沖液
③培養(yǎng)基

步驟

腸道感染病毒的分離鑒定基本步驟如下：

（一）分離培養(yǎng)

在敏感細(xì)胞系上，EV增殖后可導(dǎo)致細(xì)胞的裂解，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)。CPE大多可在接種后7天內(nèi)出現(xiàn)，正常細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變：顯微鏡下細(xì)胞變圓、縮小、細(xì)胞核固縮、折光率增加、細(xì)胞變性。對(duì)于EV滴度較低的標(biāo)本，或增殖速度較慢的EV型別，在接種后14天內(nèi)也可出現(xiàn)明顯的CPE。

由于大多數(shù)細(xì)胞系不能夠連續(xù)維持14天，因進(jìn)行EV分離時(shí)，一般需盲傳兩代，每代細(xì)胞維持7天。此外，一些型別的EV在某些細(xì)胞系上無明顯CPE，這時(shí)需要借助分子生物學(xué)方法確定EV是否分離成功。

某些標(biāo)本中含有的細(xì)胞毒性物質(zhì)可在首次接種后24小時(shí)內(nèi)引起細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、脫落。而細(xì)胞毒性反應(yīng)有時(shí)不易與CPE進(jìn)行區(qū)分，這時(shí)需要將第一代培養(yǎng)物凍化后，進(jìn)行再次接種。再次接種后，由于細(xì)胞毒性物質(zhì)被稀釋，可避免細(xì)胞毒性反應(yīng)的出現(xiàn)。

（二）核酸檢測(cè)

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，尤其是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（Real-time RT-PCR，rRT-PCR）具有快速、靈敏、特異的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于EV的核酸檢測(cè)。EV基因組在5＇UTR較為保守，以此作為檢測(cè)靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法主要用于EV的定性檢測(cè)。而以VP1編碼區(qū)作為檢測(cè)靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法則可用于EV的檢測(cè)及型別鑒定。

由于不同型別間VP1編碼區(qū)核苷酸序列差異較大，且該區(qū)變異較大，因此對(duì)所有EV型別的檢測(cè)，則需針對(duì)不同分組EV甚至不同型別EV設(shè)計(jì)多對(duì)引物或探針。某些標(biāo)本中含有的PCR反應(yīng)抑制物，以及引物、探針與病毒基因的不匹配導(dǎo)致體外擴(kuò)增失敗，都會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

從病變部位或無菌部位分離到EV或檢測(cè)到EV核酸，即可確認(rèn)EV為引起相應(yīng)臨床癥狀的病原體。由于EV存在較大比例的亞臨床感染，感染后并不引起臨床癥狀。因此，從咽拭子或糞便和肛拭子中檢測(cè)到EV病毒或核酸后，還需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)和臨床表現(xiàn)進(jìn)行具體分析，以確定EV是為致病病原。

（三）型別鑒定

根據(jù)基因特征和生物學(xué)特征，所有人EV屬于EV-A、EV-B、EV-C、EV-D共4個(gè)組。

結(jié)構(gòu)蛋白（P1），尤其是VP1編碼序列與血清型的關(guān)聯(lián)具有高度一致性。基于VP1編碼序列的EV型別鑒定方法，為當(dāng)前國際公認(rèn)的EV分型和鑒定的分子生物學(xué)依據(jù)，原則如下：

①全長VP1編碼區(qū)核苷酸序列與原型株同源性＞75％（氨基酸序列同源性＞85％ ），且與其他血清型同源性＜70％ 表明與原型株為同一型別；②全長VP1編碼區(qū)核苷酸序列與原型株同源性＜70％ 表明為不同或新的型別；③全長VP1編碼區(qū)核苷酸序列與原型株同源性在70％ 和75％ 之間，則需要通過進(jìn)一步分析其他特點(diǎn)進(jìn)行定型。

（四）血清學(xué)檢測(cè)

恢復(fù)期血清特異中和抗體的4倍或4倍以上升高可作為EV感染的血清學(xué)診斷依據(jù)。但某些EV感染病例的恢復(fù)期中和抗體升高水平＜4倍，甚至低于急性期?？赡苁怯捎诨謴?fù)期血清標(biāo)本采集較遲。
急性期血清中特異性IgM抗體檢測(cè)，可用于病毒感染的血清學(xué)診斷。EV存在較大比例亞臨床感染。因此，經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)證實(shí)的EV急性感染，是否是引起相應(yīng)臨床表現(xiàn)的原因，還需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)和臨床表現(xiàn)進(jìn)行具體分析。

注意事項(xiàng)

1．柯薩奇病毒：病毒分離、普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR均是實(shí)驗(yàn)室常用的柯薩奇病毒的檢測(cè)方法，中和試驗(yàn)因操作較為復(fù)雜多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已不采用。

值得注意的是，柯薩奇病毒A組多數(shù)型別的毒株不能在培養(yǎng)的細(xì)胞中生長，但近年研究報(bào)道，A組的一些病毒可以在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系細(xì)胞上生長，并產(chǎn)生可見的細(xì)胞病變效應(yīng)如CA-V6、CV-A10、CVA-16等。某些不易在細(xì)胞系上增殖的CV-A組病毒（CV-A19等），則可在乳鼠上進(jìn)行分離和培養(yǎng)。而CV-B組病毒則大多數(shù)可以在細(xì)胞上培養(yǎng)，人喉癌上皮細(xì)胞系可提高CV-B組病毒的分離敏感性。

2．EV-A71：比較容易通過細(xì)胞培養(yǎng)分離到。HFMD病例皰疹液中分離到病毒或檢測(cè)到病毒核酸，腦炎、腦膜炎病例腦脊液中檢測(cè)到病毒或病毒核酸，即可確認(rèn)EV-A71為致病病原。值得注意的是，EV-A71引起的腦炎及腦干腦炎患者的腦脊液中很少檢測(cè)到EV-A71病毒顆?；蚝怂?。

患者或無癥狀感染者的急性期咽拭子、糞便和肛拭子也是EV-A71病原學(xué)檢測(cè)的適宜標(biāo)本類型，一般用于確定導(dǎo)致人群疾病暴發(fā)或流行的病原。從單個(gè)患者咽拭子、糞便或肛拭子中檢測(cè)到EV-A71，還需結(jié)合臨床和流行病學(xué)數(shù)據(jù)以確定EV-A71是否為引起臨床疾病的病原。

3．EV-D70：感染后較少從呼吸道和糞便標(biāo)本中檢測(cè)到EV-D70，患者急性期結(jié)膜拭子為病原學(xué)診斷的理想標(biāo)本類型。EV-D70可在細(xì)胞上進(jìn)行分離培養(yǎng)，但標(biāo)本中病毒核酸的直接檢測(cè)有助于提高檢測(cè)陽性率。

4．EV-D68：在體外細(xì)胞中增殖較困難，且其最適培養(yǎng)溫度為33 ℃，低于大多EV的最培養(yǎng)溫度（36 ℃）。呼吸道標(biāo)本中病毒核酸的直接檢測(cè)有助于EV-D68的檢出。