通過噬菌體長尾纖維蛋白固定磁性納米粒子，實現快速、超靈敏檢測沙門氏菌
目前比較實用的檢測技術中，實時熒光定量PCR應用范圍最廣。然而，來自食物基質的抑制因素和細菌水平的初始低豐度會影響qPCR的效果。常用的解決方案是富集培養，但培養時間較長，還會出現初始細胞的損失等現象。因此，在qPCR分析之前，應采用有效且可靠的方式從受污染的食品樣品中分離和富集細菌細胞；而磁性納米粒子(MNPs)可有效富集靶細菌，靶細菌細胞的選擇性識別和結合通常通過MNP與特定適配子和抗體的功能化來實現。本文采用的方法是，用噬菌體尾部纖維蛋白(TFP)包裹MNP。因TFPs來源于噬菌體和細菌的共同進化過程，因此編碼為對宿主菌株的特定識別，無需耗時且耗費人力的篩選過程，且較容易大量生產。因此，TFPs具有巨大的潛力，可用作生物探針，與MNP一起功能化，用于靶細菌的特定分離和富集。
在這篇文章中，作者使用一株可感染多株沙門氏菌的噬菌體STP4-a，其長尾纖維蛋白(稱為LTF4-a)由形成STP4-a粘附尖端的亞基gp37和gp38組成；作者將gp37和gp38在大腸桿菌中共表達形成重組LTF4-a，然后將其功能化到MNP上以產生用于檢測沙門氏菌的生物探針，在復雜食品基質中建立了一種快速且超靈敏的沙門氏菌檢測方法，該方法允許在3小時內達到7 CFU / mL的檢測限。
重組LTF4-a的表征
圖1：蛋白LTF4-a的表征
A圖為表達載體的構建，其中gp57A是長尾纖維形成伴侶，為了最大限度地提高gp38的宿主受體結合能力，在LTF4-a的N端加入6×His-tag和3賴氨酸帽，使用高純度的大腸桿菌表達系統成功獲得重組LTF4-a蛋白，產量為6-8mg / L;B圖為表達蛋白的SDS-PAGE驗證結果。
圖2：探究LTF4-a的結合能力
為了確定LTF4-a是否能夠結合沙門氏菌細胞，將FITC標記的重組LTF4-a與鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028細胞一起孵育，并在熒光(FL)顯微鏡下檢查(圖2)。在FL顯微鏡下在鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028細胞上觀察到綠色熒光。
圖3：探究生物探針的細胞結合能力
為探究生物探針的細胞結合能力，將該生物探針和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028共孵育后，用TEM觀察細菌形態，如圖3所示。結果表明，該探針不會影響細菌形態，且可有效結合島細菌表面。
圖4：優化生物探針的反應條件
對LTF4-a-MNP生物探針的沙門氏菌細胞結合效率進行優化，分別從(1)LTF4-a-MNP的單反應體積，(2)LTF4-a-MNP與沙門氏菌培養物的孵育時間，(3)反應溶液的pH值，以及(4)反應溶液中的NaCl濃度四個條件進行優化。結果如圖4所示，紅色柱子表示最佳的反應條件。
對生物探針檢測特異性的探究，將所有測試用的細菌濃度調整一致，結果表明生物探針對沙門氏菌的回收效率不受到其他菌株的影響(圖5)。
圖5：探究生物探針的檢測特異性
評估生物探針在食物基質中的效果，結果表明，該探針在牛奶、生菜、雞蛋中的細菌回收率幾乎為100%，且該探針在4℃下保存6個月后回收效率仍然保持高水平，即說明該探針可在4℃下保存數月。
圖6：探究生物探針在食品基質中的作用效果
探究LTF4-a-MNP生物探針在實際應用中的潛力。基于LTF4-a-MNP的分離和富集(A)PBS，(B)牛奶，(C)生菜和(D)全蛋樣品后，鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028分析的qPCR線性擬合曲線。其中，1：陰性對照，2：7 CFU/mL，3：101CFU/mL， 4： 102CFU / mL，5：103CFU/毫升，6：104CFU / mL，7：105CFU/mL。
根據qPCR結果，所有測試樣品的回歸曲線均具有良好的線性范圍，LOD值為7 CFU / mL，凝膠圖像表明PCR擴增子的產生與沙門氏菌的濃度成正比。
圖7：生物探針在實際應用中的作用效果
結論：本研究建立了一種快速、超靈敏的復雜食品基質沙門氏菌檢測方法，檢測限為7 CFU/mL，檢測時間為3h，重組LTF4-a與MNP偶聯用作特異性親和配體，用于篩選來自不同食品樣品的沙門氏菌細胞，并與qPCR進一步結合，用于從預濃縮樣品中特異性和靈敏檢測目標微生物細胞。
參考文獻：Wang L, Lin H, Zhang J, Wang J. Phage long tail fiber protein-immobilized magnetic nanoparticles for rapid and ultrasensitive detection of Salmonella. Talanta. 2022 Oct 1;248:123627. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123627. Epub 2022 May 30. PMID: 35661002.
