蛋白質(zhì)濃度測定——雙縮脲法
[原理]
將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而形成雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）。
雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+結(jié)合生成紫色絡(luò)合物，這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵類似雙縮脲結(jié)構(gòu)，故亦能呈雙縮脲反應(yīng)。
在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)濃度越高，體系的顏色越深。反應(yīng)產(chǎn)物在540nm處有最大光吸收。
將未知濃度的樣品溶液與一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)與雙縮脲 試劑 反應(yīng)，并于540nm比色，可通過標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知樣品蛋白質(zhì)的濃度。
凡含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)-CSNH2、-CRHNH2、-CHNH2-CHNH2-CH2OH、-CHOH-CH2OH、-CHOH-CH2NH及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應(yīng)。
本法操作簡便，迅速，蛋白質(zhì)濃度與光密度的線性關(guān)系好，是蛋白質(zhì)濃度分析的常用方法之一，但本法缺點(diǎn)是靈敏度較低，蛋白質(zhì)量須在1～20mg/ mL方有較佳結(jié)果。在需要快速，但準(zhǔn)確性要求不高的測定中，常用此法。
[方法與步驟]
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取6支試管從0～5編號(hào)，按下表分別加入各 試劑 ，每加一種試液均須混勻，加畢后于室溫放置30分鐘，然后以0號(hào)管作為空白對照管，540nm處測定各管A值。
管號(hào) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白/mL 蒸餾 水/mL 雙縮脲試劑/mL | 0 1.0 4.0 | 0.2 0.8 4.0 | 0.4 0.6 4.0 | 0.6 0.4 4.0 | 0.8 0.2 4.0 | 1.0 0 4.0 |
以標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白（mg）為橫坐標(biāo)，A 540值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
未知濃度的樣液測定
可用牛奶中提取的酪蛋白配制溶液。未知酪蛋白濃度的樣品測定3管。方法步驟與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程的5號(hào)管相同，僅用未知濃度酪蛋白溶液1.0mL代替標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與未知濃度蛋白測定過程是同時(shí)進(jìn)行的。
根據(jù)未知濃度酪蛋白試液的A540值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的蛋白毫克數(shù)，即為所測酪蛋白溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)。
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