水產品中甲基睪酮殘留量的測定——液相色譜法
1范圍
本標準規定了水產品中甲基睪酮殘留量的液相色譜測定方法。 本標準適用于水產品可食部分中甲基睪酮殘留量的測定。
2規范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。
GB/T 6682分析實驗室用水規格和試驗方法
3原理
以乙醚提取樣品中的甲基睪酮,經過液-液萃取，用C18柱進行色譜分離,利用甲基睪酮具有紫外特征吸收,外標法定量。
4試劑
所有試劑應無干擾峰，分析純試劑應重蒸。水應符合GB/T 6682 一級水的要求。
4.1甲基睪酮標準品:純度≥98%。
4.2甲醇:色譜純。
4.3甲醇溶液：甲醇：水=4：1。
4.4石油醚:分析純。
4.5無水乙醚:分析純。
4.6甲基睪酮標準儲備液:準確稱取甲基睪酮0. 0010 g,用甲醇溶解,定容于50 mL容量瓶中，使成濃度為20μg/mL的標準溶液，-18°C存放，存放時間不超過6個月。
4- 7甲基睪酮標準工作液:使用前用甲醇稀釋成1 μg/mL工作液，可4°C暫時存放。
5儀器
5.1液相色譜儀:配紫外檢測器。
5.2電子天平:感量0.000 1 go
5.3勻漿機。
5.4磁力攪拌器。
5.5離心機:最大轉速5 000 r/min0
5.6振蕩器。
5.7減壓旋轉蒸發器。
5.8雞心瓶：50 mL。
5.9具塞玻璃離心管：10 mL。
5.10 離心管：50mL。
5.11聚四氟乙烯膜:孔徑0. 45 μm。
6操作方法
6.1樣品處理
取水產品可食部分，切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿，取5. 00 g(精確至0. 01 g)于50 mL燒杯中。
6.2分離純化
6. 2. 1提取
向燒杯中加入15 mL乙醚，磁力攪拌15 min,轉移至50 mL離心管中，用5 mL乙醚洗凈燒杯，合并至離心管,5 000 r/min離心10 min,所得上清液轉移至雞心瓶;殘渣用15 mL乙醚按上述方法再提取一次, 所得上清液合并至雞心瓶，在40°C左右水浴條件下減壓旋轉蒸發至干，殘渣中加入5 mL甲醇溶液清洗瓶壁，溶液轉移至10 mL具塞玻璃離心管中。
6.2.2純化
加入4 mL的石油醚至上述離心管中,加塞劇烈振蕩1 min?2 min,4 000 r/min離心10 min,用滴管吸棄上層石油醚層;下層加入4 mL的石油醚按上述方法再洗滌一次。下層甲醇溶液在40°C左右水浴條件下減壓旋轉蒸發至約0. 5 mL，轉移至10 mL具塞離心管。加入2 mL水清洗瓶壁，合并水溶液，加入 4 mL的乙醚，振蕩1 min?2 min,混勻，4 000 r/min離心10 min,吸取上層乙醚層于雞心瓶中；下層用 4 mL乙醚再提取一遍，吸取上層，合并至雞心瓶中。在40°C左右水浴條件下減壓旋轉蒸發至干，準確加入 ImL流動相溶解殘渣。經聚四氟乙烯膜過濾，待上機分析。
6.3測定
6.3.1測定條件
6.3.1.1色譜柱:C18柱，250 mmX4. 6 mm，柱填料粒徑5 μm；或相當者。
6.3.1.2 流動相：甲醇:水=70 : 30；流速：0. 8mL/min。
6.3.1.3 柱溫：30°C。
6.3. 1.4進樣量：20μL。
6.3.1.5 檢測波長：254 nm。
6.3.2色譜分析
分別注入20μL濃度為1 μg/mL標準工作溶液和樣品提取溶液于液相色譜儀中，按上述色譜條件進 行色譜分析,記錄峰面積,響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。根據標準樣品的保留時間定性,外標 法定量。標準品色譜圖參見附錄A。
7結果
7.1計算
樣品中甲基睪酮的含量按式(1)計算。
式中：
X ——樣品中甲基睪酮含量，單位為微克每千克(μg/kg)；
Cs ——標準溶液中甲基睪酮含量，單位為微克每毫升(μg/mL)；
A——試樣液中甲基睪酮的峰面積；
V——樣品提取物溶液體積，單位為毫升(mL)；
As-—標準溶液中甲基睪酮的峰面積；
m——樣品重量，單位為克(g)。
7.2方法回收率
本方法的回收率法≥75%。
7.3方法檢測限
本方法檢測限：10μg/kg。
7.4方法重復性
本方法重復性小于10%。
7.5方法的線性范圍
本方法的線性范圍：0. 05 μg/mL~10μg/mL。
文章來源：《水產品獸藥殘留限量及監測方法查詢手冊》
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