PCR標(biāo)本的處理及模板制備的注意點(diǎn)
不同來(lái)源的標(biāo)本的處理及模板制備是PCR反應(yīng)中關(guān)鍵之一。從理論上講PCR具有極高的敏感性和特異性，甚至在數(shù)小時(shí)內(nèi)通過(guò)幾十次循環(huán)可以檢測(cè)到一個(gè)或幾個(gè)靶基因目的DNA的存在。但是在實(shí)踐中人們常會(huì)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本的處理和模板的制備不僅影響著PCR反應(yīng) 的成敗，而且影響著其反應(yīng)的敏感性和特異性。
為了保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行，十多年來(lái)人們已先后建立了許多常規(guī)標(biāo)本處理的方法，但是近年來(lái)PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用， 要求在保證準(zhǔn)確性的前提下，快速、簡(jiǎn)便、特異性地對(duì)疾病作出診斷。臨床醫(yī)生要在極短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)處理數(shù)量龐大的微量標(biāo)本，這就要求各PCR 試劑 盒生產(chǎn)廠家提供符合上述要求的臨床標(biāo)本處理 試劑 盒。
標(biāo)本的處理及模板的制備應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
1． 臨床標(biāo)本的取樣來(lái)源要準(zhǔn)確，標(biāo)本的處理要及時(shí)。如不能及時(shí)處理要置-20℃低溫保存。如被檢物為RNA，則待測(cè)標(biāo)本應(yīng)在2小時(shí)以內(nèi)作出處理。
2． 標(biāo)本預(yù)處理的目的是有效地釋放出被測(cè)病原體及消除標(biāo)本中存在的抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)的抑制物。由于各種病原體侵染人體部位及途徑各不相同，臨床標(biāo)本來(lái)源各異，如外周血、尿、大便、痰、胸腹水、支氣管灌注液、心包積液、咽部分泌物、各種癌組織、石蠟切片、尿道分泌物、絨毛、尖銳濕疣、陰道分泌物等等。標(biāo)本的預(yù)處理也就不盡相同，但其目的完全相同。同時(shí)也應(yīng)注意在標(biāo)本的預(yù)處理中，要防止標(biāo)本的降解，若為RNA標(biāo)本最好加入抑制RNA酶的試劑。
3． 模板制備的目的是制備適于PCR擴(kuò)增的核酸，以確保PCR擴(kuò)增的敏感性和特異性，盡量防止非特異性擴(kuò)增。過(guò)去，DNA模板的制備中常采用加 蛋白酶 K、GDS等處理標(biāo)本，然后用氯仿一酚抽提，無(wú)水乙醇沉淀DNA的方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是制備的DNA純度較高，PCR擴(kuò)增的特異性好；缺點(diǎn)是操作麻煩，易造成微量標(biāo)本的丟失或標(biāo)本間的交叉污染，不適于臨床標(biāo)本的處理。
針對(duì)臨床標(biāo)本的特點(diǎn)，許多新的、快速處理標(biāo)本的方法應(yīng)運(yùn)而生，尤其是各類快速核酸提取試劑盒的研發(fā)生產(chǎn)，為PCR技術(shù)在臨床標(biāo)本檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用提供了保證。
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