DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白
(一) 原理
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉變為OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為PH6.85～7.5)，其余均屬酸性蛋白。在PH7.2～7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。
(二) 試劑 和器材
1、 試劑 :
(1)鹽析提取的人γ球蛋白；
(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3；
(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；
(4)0.1M, PH7.4 PB(配制見鹽析部分)；
2、器材:
(1)層析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗(200目)；
(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導儀、抽濾裝置(包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶)，PH計；
(3)透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙；
(4)量筒、燒杯、 試管 、吸管、滴管、滅菌小瓶等。
(三) 操作步驟
1、DEAE-Sephadex A-50預處理
稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過程處理，最后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中過夜。
2、裝柱
(1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。
(2)將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。
(3)關閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3、平衡:啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口，停止平衡。
4、加樣及洗脫:
啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應〈床體積的2％，蛋白濃度以〈100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12～14滴／分鐘。
5. 收集：開始洗脫的同時就以 試管 進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6. 測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。
7. 合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG(MW6000)洗縮至所需體積，加入0.02％NaN３防腐劑，于4℃保存備用。
8. A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm〈0.02，再以 蒸餾 水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫 緩沖液 中４℃保存；近期不用時，以無水酒精洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內保存。
(四) 注意事項
1. 柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
2. 純化過程必須嚴格控制脫 緩沖液 的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進行柱層析。
3. 所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。
4. 洗脫過程中應嚴格控制流速，且勿過快。
5. 上樣的體積要小，濃度不宜過高。
6. 加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。
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