蛋白質分子量測定[凝膠層析法]
一、實驗目的
1. 了解凝膠層析的原理及其應用。
2. 通過測定蛋白質分子量的訓練，初步掌握凝膠層析技術。
二、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽、去熱源等，而測定蛋白質的分子量也是它的重要應用之一。凝膠是一種具有立體網狀結構且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質。用它來分離物質，主要是根據多孔凝膠對不同半徑的蛋白質分子（近于球形）具有不同的排阻效應實現的。亦即它是根據分子大小這一物理性質進行分離純化的。對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。
凝膠層析分離原理示意圖參見64頁的“圖 3－5”。
對于任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱中被排阻的范圍均在0～100%之間，其被排阻的程度可以用有效分配系數Kav（分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示，Kav值的大小和凝膠柱床的總體積（V t ）、外水體積（V 0 ）以及分離物本身的洗脫體積（V e ）有關：
Kav = (V e －V 0 )/(V t －V 0 ) ----------- (1)
在限定的層析條件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是隨著分離物分子量的變化而改變。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65頁的“圖 3－6”畫出了凝膠層析柱中凝膠自身（基質）體積（V g ）、外水體積（V 0 ）、內水體積（V i ）及柱床總體積（V t ）的示意圖。
65頁的“圖 3－7”示出了凝膠層析柱中的幾種層析峰。
有效分配系數Kav是判斷分離效果的一個重要參數，同時也是測定蛋白質分子量的一個依據。在相同層析條件下，被分離物質Kav值差異越大，分離效果越好。反之，分離效果差或根本不能分開。在實際的實驗中，我們可以實測出V t 、V 0 及V e 的值，從而計算出Kav的大小。對于某一特定型號的凝膠，在一定的分子量范圍內，Kav與logMw (Mw表示物質的分子量) 成線性關系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C為常數。
同樣可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’為常數。即 Ve 與 logMw 也成線性關系。我們可以通過在一凝膠柱上分離多種已知分子量的蛋白質后，并根據上述的線性關系繪出標準曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。
三、器材與 試劑
（一）器材
1. 玻璃層析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒壓貯液瓶）
3. 自動部分收集器
4. 紫外分光光度計
5. 100ml 試劑 瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml燒杯
8. 50ml、100ml燒杯
9. 10ml（或5ml）刻度試管
（二）試劑
1. 標準蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）雞卵清清蛋白：Mw=45,000（美國SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美國SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白質樣品：由實驗室準備
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脫液1000ml）
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