蛋白質(zhì)分子量測定：凝膠過濾層析法
一、目的：
（1）初步掌握利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理。
（2）學(xué)習(xí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液制作V e ，K av 對(duì)1gMr的“選擇曲線”以及測定未知蛋白質(zhì)樣品分子量的方法。
二、原理：
凝膠層析法（即凝膠過濾法，gel filtration）是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，又叫做分子篩層析法（molecular sieve chromatography），排阻層析法（exclusion chromatography）。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同進(jìn)行分離，好象過篩可以把大顆粒與小顆粒分開一樣。但這種“過篩”與普通的過篩不一樣。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。分離過程中的示意見圖17-1。
凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，它們的內(nèi)部都具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝膠是聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝膠，后者的商品名稱為Sephadex型的各種交聯(lián)葡聚糖凝膠，它是個(gè)有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖17-2所示。
這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離物質(zhì)分子的大小有相應(yīng)的數(shù)量級(jí)。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只有相應(yīng)的小分子可以通過，適于分離小分子物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適于分離大分子物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。
為了說明凝膠層析的原理，將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt（total volume）表示。實(shí)際上Vt是由V o ，V i 與V g 三部分組成，即：
V t =V o +V i +V g
V o 稱為“孔隙體積”或“外體積”（outer volume）又稱“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動(dòng)相的體積；V i 為內(nèi)體
積（inner volume），又稱“內(nèi)水體積”，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，相應(yīng)于一般層析法中的固定相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水后的重量求得；Vg為凝膠本身的體積，因此V t —V o 等于V i +V g 。它們之間的關(guān)系可用圖17-3表示。
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