考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度

【原理】
考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250 的最大光吸收峰在465nm，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物時，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm。考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)定量測定的高敏性度。
在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復合物呈青色。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì) 含量呈線性關系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。
【操作】(常量法)
(一)標準曲線制備：
配制lmg／ml的標準蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。
按下表操作：
搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對照管，在721型分光光度計于波長595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標，各標準樣品濃度(μg／ml)作為橫座標作圖得標準曲線。
(二)未知樣品測定：
取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻。(此法樣品稀釋200倍)。
取試管二只，按下表操作：
搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計亡波長595nm比色，讀取光密度，查標準曲線，求得稀釋樣品蛋白質(zhì)濃度。
【計算】
未知樣品蛋白質(zhì)濃度μg／ml＝稀釋樣品濃度×稀釋倍數(shù)
【優(yōu)缺點】
(—)操作簡便、快速；檢測靈敏；重復性好。
(二)顯色迅速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在l小時內(nèi)是穩(wěn)定的。
(三)與改良Lowry氏法相比，干擾物質(zhì)較少。
(四)當樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉(SDS)、TritonX-100等去垢劑時，顯色反應會受到干擾。如樣品緩沖液呈強堿性時也會影響顯色，故必須預先處理樣品。
(五)考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。
(六)微量法測定蛋白含量范圍為1-10μg；常量法測以檢測范圍10-100／μg為宜。
【器材】
(一)試管l0支
(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。
（三）721分光光度法，普通比色杯4只。
【 試劑 】
(一)O.9％NaCl
(二)待測血清
(三)標準血清
(四)染液：考馬斯亮蘭G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加 蒸餾 水定容到1000ml。[此時溶液為0.0l％考馬斯亮蘭G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。

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