DNA酶切及凝膠電泳

第一節(jié) 概 述 

一. DNA 的限制性內(nèi)切酶 酶切分析限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA 的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3"3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當(dāng)微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1 倍體積3mol/L NaAc 和2 倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃ 低溫冰箱30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應(yīng)。DNA 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA 序列分析、基因組 的功能圖譜繪制、DNA 的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。構(gòu)建DNA 限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。

酶切圖譜的使用價值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃ )。對質(zhì)粒 DNA 酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。

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