分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)知識簡介

外來基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過程叫轉(zhuǎn)化（transformation），以噬菌體把外源基因?qū)爰?xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過程叫轉(zhuǎn)位（transposition），這些游動的基因叫轉(zhuǎn)位子。

一、基因工程的常用工具

（一）載體

載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征。

　　質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個細(xì)胞可復(fù)制1-5個質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個細(xì)胞可復(fù)制30-50個質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個基本基因，如復(fù)制起動區(qū)（復(fù)制原點Ori），便于復(fù)制擴增；抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素Ap ^r 、抗四環(huán)素Tc ^r 等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點。

常用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删wM13系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細(xì)胞配合使用。以上載體各有特點，便于選擇，靈活應(yīng)用。

（二）工具酶

工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。

限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴(yán)格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對稱。切口分開端和粘端，產(chǎn)生3′－OH和5′－P末端。內(nèi)切酶品種多，使用時應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應(yīng)條件。

　　連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應(yīng)需有Mg ²⁺ 和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。

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