采用高效液相色譜法純化小鼠腹水中單克隆抗體實(shí)驗(yàn)步驟

• 從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親和層析等。應(yīng)用TSK DEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物學(xué)活性。
  (一)　原理
  根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAb γ 球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過增加洗脫液中的離子強(qiáng)度，洗脫并收集蛋白峰。
  (二)操作步驟

腹水10,000 g離心10min，除去細(xì)胞和雜質(zhì)，在4 ℃條件下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，

使終濃度為40%飽和硫酸銨

攪拌20～30min

離心，沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對緩沖液A(PH8.5 20 mM Tris緩沖液)透析除鹽

4 ℃過夜

用帶有1000 μl樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的

TSK DEAE SPW離子交換層析柱

洗脫流速1 ml/min

0～1min：5%緩沖液B(20 mM Tris, PH8.5, 含2.0 M醋酸鈉)

1～20min(線性梯度洗脫)：20%緩沖液B

20～22min：20%緩沖液B

洗脫液用紫外280 nm進(jìn)行監(jiān)測

收集蛋白峰，進(jìn)行含量、純度和活性測定

(三)　試劑和器材

1.    TSK DEAE SPW離子交換層析柱(75×7.5 mm, Bio Rad)

2.　高效液相色譜儀(包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280 nm監(jiān)測系統(tǒng))。

3.　PBS，緩沖液A和B

(四)　注意事項(xiàng)

1.　所用緩沖液和加樣粗提物均需0.22 μm濾膜過濾。

2.　在本實(shí)驗(yàn)條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11～12min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb的存留時(shí)間(retention time)有所差異。

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