植物材料基因組多態性分析

一、 RAPD 技術的原理

RAPD 技術是由美國的 Williams 等人于 1990 年發明的。它是以聚合酶鏈反應技術 (PCR 技術 ) 為基礎，利用人工合成的寡核苷酸為引物，以從組織中分離出來的基因組 DNA 為模板，通過基因放大器合成多態性 DNA 片段的一種方法。由于不同品種 DNA 序列存在著差異，其引物結合位點以及兩結合位點之間的距離都有差異，這樣經 PCR 擴增后就產生了 DNA 片段的多態性，從而形成了 RAPD 標記。 RAPD 標記具有以下特點：

⑴、標記數量多，因為 RAPD 分析所用引物的數量是無限的，所以它可以覆蓋基因組中所有的位點。

⑵、標記所需模板 DNA 量小，因此不受季節、組織、器官及發育時期的限制。

⑶、所用引物沒有物種限制，一套引物可以用于不同生物基因組分析。

⑷、分析方便、快速、無需克隆自卑、同位素標記、 Southern 轉移等復雜的操作。

⑸、標記是顯性的，因此不能區別生物個體是純合型還是雜合型。

目前， RAPD 技術已廣泛用于基因定位，尋找特定基因的連鎖標記，物種識別，系統進

化，遺傳多樣性檢測，遺傳作圖和遺傳育種等眾多領域。

由于 RAPD 技術是以 PCR 技術為基礎的，因此為了更好的掌握 RAPD 技術，有必要先了解 PCR 技術。

1、 PCR 技術的原理

多聚酶鏈式反應技術簡稱 PCR 技術，是近年發展起來的一種體外擴增特異 DNA 片段

的技術，此法操作簡單，可在短時間內獲得數百萬個特異序列的拷貝，因此 PCR 技術雖然問世時間僅數年，但它已迅速滲透到分子生物學的各個領域。在分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫學、考古學等方面得到了廣泛的應用。

PCR 技術與細胞內發生的復制過程十分類似，為在模板 DNA 、引物（ 16bp 以上，最好為 20~24bp ）和 4 種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于 DNA 聚合酶的酶促合成反應。按照反應的特點可將其分為三步：①、變性：通過加熱使 DNA 雙螺旋的氫鍵斷裂，雙連解開形成單鏈；②、退火：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物 DNA 量大大多于模板，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板 DNA 雙鏈之間互補的機會較少；③、延伸：在 DNA 聚合酶和 4 種脫氧核苷三磷酸底物及 Mg² 存在的條件下，由 DNA 聚合酶 5’ → 3’ 的聚合酶活性催化以引物為起點的 DNA 鏈延伸反應。以上 3 步為一個循環，每一循環的產物均可作為下一個循環的模板，數小時之后，介于兩個引物之間的特異性 DNA 片段將得到大量的復制，數量可達到 2 × 10^6~7 拷貝。

2、 RAPD 的原理

RAPD 技術通常是利用一系列（通常數百個）不同堿基順序隨機排列的寡聚核苷酸單鏈

（通常為 10bp ）為引物，對所研究基因組 DNA 進行 PCR 擴增。 RAPD 所用的一系列引物 DNA 序列各不相同，但對于任一一對特定的引物（可相同也可不同），如它們同基因組 DNA 序列有其特定的結合位點，這些特定的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合 PCR 擴增反應的條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補位置，且引物 3’ 端相距在一定的長度范圍之內（ 200~2000bp ），就可擴增出 DNA 片斷。因此如果基因組在這些區域發生 DNA 片斷插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化，而使 PCR 產物增加、缺失或發生分子量的改變。通過對擴增產物的檢測即可測出基因組 DNA 在這些區域的多態性，由于進行 RAPD 分析時可用引物數很大，雖然對每一對引物而言其檢測基因組 DNA 多態性的區域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組，因此 RAPD 可以對整個基因組 DNA 進行多態性檢測。兩個物種的個體之間，親緣關系越接近，其相應的 PCR 擴增帶型也就越相似，反之則差異也就越懸殊。

二、多態性 DNA 隨機放大的條件

大多在 Williams 等（ 1990 ）的基礎上變動。一般每一個樣品的最后混合液為 25ul ，其中

含 25ul 10 ×的 DNA 聚合酶緩沖液（由 Tris-HCl ， KCl ， MgCl₂ 和明膠等配成），各占 100umol/L 的 dATP 、 dGTP 、 dCTP 和 dTTP ， 0 ． 2umol/L 的引物， 20~25ng 的模板 DNA 和 0 ． 5 單位酶量的 DNA 聚合酶，然后用蒸餾水將混合物加到 25ul 。

三、影響 RAPD 的因素

1 、引物

引物的合成是隨機的，但要滿足以下兩個條件： G C 的含量不低于 40% ， 5’ 與 3’ 端的堿

基順序非反方向對稱，否則就無法合成專一的少數幾條 DNA 片段。引物的長度以 10bp 為佳，引物太短（＜ 9bp ）易從模板上脫落，聚合反應難以進行，引物太長，成本提高，合成多態性 DNA 片段的可能性降低。

引物的濃度通常是 0 ． 2umol/L ，這一濃度足以完成 40 個循環的擴增反應，引物濃度過高可能導致錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者均可競爭酶、 Dntp 和引物。但如引物濃度不足，則 PCR 的效率極低，擴增產物的產量太低。

2 、 Taq DNA 聚合酶：

酶在 70 ℃ ~75 ℃ 時具有最高的活力，此溫度下每一個酶蛋白分子每秒可延伸約 150 個核苷酸，溫度升高（＞ 80 ℃ ）或降低（＜ 70 ℃ ）時，聚合酶延伸速度明顯下降。該酶具有良好的熱穩定性， 95 ℃ 保溫 2 小時，活性未見明顯損失。

該酶具 5’ → 3’ 聚合酶活性和 5’ → 3’ 外切酶活力，但無 3’ → 5’ 的外切酶活力，因此，如 PCR 反應中發生某些核苷酸的錯配，該酶沒有校正功能。

該酶為 Mg² 依賴性酶， MgCl₂ 濃度在 2 ． 0mmol/L 時酶活力最高， Mg² 濃度偏高，酶活力受抑制。由于 Mg² 能與負離子或負離子團（如磷酸根等）結合，在 PCR 反應中模板 DNA 、引物及 dNTP 均可與 Mg² 結合，尤以 dNTP 的影響最大，所以 MgCl₂ 濃度在不同反應體系中應適當進行調整，一般反應中 Mg² 濃度至少應比 dNTP 總濃度高出 0 ． 5~1 ． 0mmol/L 。

KCl 的最適濃度是 50mmol/L ，高于 75mmol/L 時 PCR 反應明顯抑制，均衡的 dNTP 有利于酶活性的發揮，并能減少錯配和獲得多量的特異性 DNA 擴增產物。

在 25ul 反應體系中，聚合酶的用量為 1~2U ，根據擴增片斷的長度及復雜程度（ G C 含量）不同而有所區別，使用聚合酶濃度過高，可引起非特異產物的擴增，濃度過低，則合成的產物量減少。

3 、底物（ dNTPs ）

dNTPs 溶液應在 -20 ℃ 存放，過多的凍融會使 dNTPs 降解。在 RAPD 反應中， dNTPs 濃

度系在飽和濃度 (200umol/L) 下使用， dNTPs 濃度過高可加快反應速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本，反之，低濃度的 dNTPs 會導致反應速度的下降，但可提高試驗的精確性。 4 種 dNTPs 在使用時必須以等當量濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率，此外，由于 dNTPs 可能與 Mg² 結合，因此，應注意 Mg² 濃度和 dNTPs 濃度之間的關系。

4 、反應的緩沖液

緩沖液成分： 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室溫下 pH=8 ． 4 ）

1 ． 5mmol/L MgCl₂

緩沖液中能影響反應的特異性和擴增片斷的產率，在一般的 PCR 反應中， 1 ． 5~2 ． 0mmol/L 是比較合適的（對應 dNTP 濃度為 200umol/L 左右）， Mg² 過量能增加非特異擴增并影響產率。由于 Mg² 的最佳作用濃度相當低，因此所制備的模板 DNA 中不應含有高濃度的鰲合劑，如 EDTA ，不應含有高濃度的帶負電荷的離子基團，如磷酸根。

緩沖液中的 BSA 和明膠對酶起保護作用。 KCl 在 50mmol/L 時能促進引物退火，大于此濃度時將會抑制 TaqDNA 聚合酶的活性。 10~50mmol/L Tris-HCl ， pH8 ． 4 ，起調節 pH 使 TaqDNA 聚合酶的作用環境維持偏堿性。

5 、 RAPD 的循環參數

PCR 擴增是由變性、退火、（復性）和延伸三個步驟反復循環組成的。其中每一步的溫度、時間以及循環次數等參數是非常重要的。

⑴、變性

一般選擇 94 ℃ ， 30s~1min ，可使各種復雜的 DNA 分子完全變性。應根據模板 DNA 的復雜程度，調整變性溫度和時間。對 GC 含量高的 DNA ，應用較高的變性溫度和時間。若變性不充分，會影響 PCR 產物的產量，反之若過度變性（溫度過高，時間過長）會對 TaqDNA 聚合酶活性和 dNTP 分子造成損壞。 RAPD 反應由于用基因組 DNA ，因此變性時間稍長為 1min 。

⑵、退火

由于 RAPD 的引物短，因此退火溫度應比常規 PCR 溫度（ 50 ℃ ）低，為 36 ℃ ，溫度過高會引起引物從模板上脫落。退火時間也比常規 PCR(30s) 長，為 1min30s ，以利于引物與模板 DNA 的牢固結合。

⑶、延伸

延伸溫度應選擇在 70~75 ℃ 之間，此時， TaqDNA 聚合酶具最高活力。 RAPD 反應由于引物過短，延伸溫度不利過高，否則不利于引物與模板的結合。 RAPD 中可采用使反應溫度緩慢升高到 70~75 ℃ 的方法，因為在最初較低溫度下， DNA 聚合酶已催化延伸反應開始（ 1 ． 5 個 bp/s ），接下來的較高溫度不會對這種延伸過的引物和 DNA 模板的結合發生影響。延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般 1 分鐘延伸足以完成 2kb 的序列，擴增片段在 2kb 以上，則需加長延伸時間。 RAPD 反應由于擴增片段的長度是隨機的，有可能有 2kb 以上的片段，因此延伸時間比常規 PCR(1min) 長，為 1min30s 。

⑷、循環次數

RAPD 一般為 35~40 個，循環次數的選擇主要取決于模板 DNA 的濃度，濃度高，則循環次數可降低，過高的循環次數（＞ 40 次），則會增加非特異性產物的量及其復雜度。

5 、模板

RAPD 反應由于引物序列短，擴增片段隨機，因此為獲得理想的結果，除模板中不應含有高濃度的 EDTA 和鹽離子外，對模板的純度要求甚高， OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 最好在 1 ． 8 ， OD₂₆₀ /OD₂₃₀ ＞ 2 ． 0 ，工作濃度一般為 50~100ng 。

此外，如模板為環狀，則應先將其線狀化，因閉環 DNA 的擴增效率低。

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