分子生物學的常見問題與解決方案

一、Southern雜交
問題1：電泳后發(fā)現(xiàn)凝膠中DNA擴散，導致結(jié)果難以確定，如何解決這一問題？
解決方案：

（1）在操作上：電泳時隔孔上樣，電泳后要對凝膠及時處理使凝膠干燥；

（2）瓊脂糖的質(zhì)量應該較好，尤其是不應含有內(nèi)切酶，否則有時將使低拷貝數(shù)基因的雜交結(jié)果難以解釋。
問題2：傳統(tǒng)方法中轉(zhuǎn)膜不完全的問題如何克服？
解決方案：經(jīng)典的向上轉(zhuǎn)移法會使凝膠短時間內(nèi)變薄,此時即使延長轉(zhuǎn)移時間至24小時以上,也不能使大分子DNA良好地轉(zhuǎn)移出去,因此,轉(zhuǎn)膜不完全。向下轉(zhuǎn)膜法由于不需在吸水紙上增加重量,凝膠基本不變形；加之吸水紙的吸力與水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的轉(zhuǎn)移,它不需要特殊的儀器,轉(zhuǎn)移速度較快,轉(zhuǎn)移效率高。
利用地高辛標記探針進行 Southern 雜交時，對于大于15kb的 DNA片斷，轉(zhuǎn)膜之前用鹽酸進行脫嘌呤可以促進轉(zhuǎn)膜效率, 但脫嘌呤過度可導致分子量相對較小的 DNA 被打斷成過小的片段而難以和尼龍膜結(jié)合。如果實驗轉(zhuǎn)膜過程中同時含有大于 15kb的DNA(通常為基因組)和小片段DNA(通常是基因組酶切產(chǎn)物)，那么在轉(zhuǎn)移的過程中傾斜容器，僅使凝膠上半部分浸泡于鹽酸，這樣既可以提高大片斷 DNA 的轉(zhuǎn)移效率，又不會打碎小片段DNA。
另外，等采用瓊指糖凝膠直接雜交的方法，來解決這一難題：以轉(zhuǎn)基因鼠的檢測為例，實驗步驟如下：

1.轉(zhuǎn)基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’調(diào)控區(qū)指導人G-CSF基因為構(gòu)件，建立轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測采用剪取鼠尾DNA做Southern進行鑒定。

2.瓊脂糖凝膠直接雜交

(l)用BanHI(150U)對由假孕鼠產(chǎn)生的仔鼠剪尾提取基因組DNA10μg酶切過液，取少量電泳檢查酶切完全后，上樣電泳8小時，

(2)將電泳槽板連同凝膠置50℃放置3小時，用鑷子輕輕揭起凝膠，放于變性液 (0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分鐘，轉(zhuǎn)置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分鐘，將膠放于玻璃板上瀝干液體，室溫放置30分鐘。

(3)干膠應立即雜交。先將膠在水中泡一下，以利于操作。

(4)將膠放人雜交液(6×SSC、5×Denhardt’S、 0.25%SDS、100μg/ml鮭魚精DNA)，加人探針，42℃雜交16-20小時。

(5)雜交完成后，洗膜8輪，42℃每次15分鐘。 2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗兩次，在冰水中浸泡2分鐘，以利于鹽的排出。

(6)干燥后按檢測試劑盒操作，室溫壓片0.5-2小時。沖片照相。使用的探針為G-CSF。DNA，探針標記采用 Fluorescein-12-dUTP，檢測試劑盒為杜邦公司產(chǎn)品，操作按試劑盒說明書進行。用瓊脂糖凝膠直接雜交的方法，較好地解決了微量核酸或低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的檢測問題，結(jié)果不僅直觀，而且特異性好。與常規(guī)的Southern雜交相比，它所具有的優(yōu)勢是，它省略了將DNA進行轉(zhuǎn)膜的步驟，從而避免了因轉(zhuǎn)膜不完全所造成的DNA量的損失，特別是低拷貝數(shù)基因的丟失。另一方面，也使復雜的Southern雜交操作程序大大簡化。因此，在轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定中以及微量核酸檢測、疾病診斷中是防止低拷貝數(shù)基因漏檢的一種可行途徑。
問題3：在向下轉(zhuǎn)膜法中，如何提高轉(zhuǎn)膜效率？
解決方案：

1、轉(zhuǎn)移液的水平面應略低于凝膠的水平面。如果轉(zhuǎn)移液的水平面高于凝膠，短時間內(nèi)會有大量液體聚集在凝膠上，直接從側(cè)面流失；果轉(zhuǎn)移液的水平面過分低于凝膠，影響紗布的吸水力，轉(zhuǎn)移效率下降。

2、吸水紙吸水后易變形，使吸水紙與濾紙間產(chǎn)生空隙，而降低吸水紙的吸水效率，應及時更換吸水紙。

3、過夜轉(zhuǎn)移時，及時添加轉(zhuǎn)移液，防吸干。

4、樣本豐度高時，移時間可以縮短至1小時，此時凝膠上仍可見大分子量DNA的殘留，當樣本豐度低時，以延長轉(zhuǎn)移時間。

5、紗布上不要加蓋重物，防凝膠受壓變薄，響轉(zhuǎn)移效率。
問題4堿轉(zhuǎn)移結(jié)束后的尼龍膜潮濕不利于保存，且防止長期保存過程中DNA結(jié)合不緊密影響雜交效果，應如何做？
解決方案：將尼龍膜置于濾紙上干燥片刻，在紫外交聯(lián)儀中將轉(zhuǎn)有DNA的一面向上12000J交聯(lián)4 min，若尼龍膜暫不雜交，可在4℃下保存?zhèn)溆玫娣艜r間不宜超過半年。
問題5使用堿轉(zhuǎn)移法，將導致雜交后探針的去除困難，幾乎80%-90%的探針難以洗脫，如何解決這一問題？
解決方案：將煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷卻至室溫,可除去膜上已雜交的DNA探針。洗脫后的尼龍膜,可反復用于其他探針的雜交(至少可耐5輪雜交與洗脫)。

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