原代細胞的培養和維持

一、原代細胞的培養與維持

1、靜置貼壁細胞（包括半貼壁細胞的培養）

凡經消化液處理實體組織來源的細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L,培養基可用Eagle（MEM）或DNEM培養，小牛血清濃度為10%~80%。在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發生脫落，漂浮。

貼壁細胞長成網狀或基本單層時，由于營養缺乏，代謝產物增多，pH變酸，不適宜細胞生長，此時細胞還未長成單層，未達到飽和密度，仍需繼續培養，因此，需采取換液方式來更新營養成分以滿足細胞繼續生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養液相同的等量完全培養基。

2、懸浮細胞的培養

凡來自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結、骨髓的淋巴細胞、造血干細胞以及白血病細胞，在原代培養時要盡量去除紅細胞。若要將淋巴細胞及白血病細胞進行長期培養，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長，待細胞開始增殖甚至結成小團塊，培養基中pH變酸，說明細胞生長繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時盡量使細胞不丟失），待細胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發生明顯變化時，此時可考慮傳代。

懸浮細胞在未達到飽和密度時，但培養基中的營養成分并不能維持細胞的營養需求時，只能采用半量換液的方式。

二、原代細胞培養的首次傳代 （Subculture）

這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。每進行一次分離再培養稱之為傳一代，傳至5~10代以內的細胞通常稱為次代培養細胞，傳至10~20代以上的細胞，通常確定為傳代細胞（或稱傳代細胞系）。傳代細胞系的建立，關鍵是初代培養的首次傳代。應注意如下幾點：

（1）細胞生長密度不高時，或未能達到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。

（2）原代培養的貼壁細胞多為混雜細胞，形態各異，往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存，采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間，因成纖維細胞易于脫壁，上皮細胞不易脫壁，因此，可根據需要選用適當的消化時間及時中止消化。在早先傳代時，其消化時間比一般已建系的細胞相對長一些。

（3）吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細胞的機械損傷。

（4）首次傳代時細胞接種數量要多一些，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養瓶，盡量減少細胞損失。

（5）首次傳代培養時的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當加大至15%~20%左右。

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