大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)
液體配制:
硼酸硼砂緩沖液:0.05M四硼化鈉45ml,0.2M硼酸55ml,pH8.4;
胰酶-EDTA消化液:胰酶-0.125g;EDTA-0.2g;D-Hanks平衡鹽液定容至100ml
所用的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或玻片預(yù)先經(jīng)100μg/L多聚賴(lài)氨酸硼酸鹽緩沖液于37℃包被4h,三蒸水洗三遍晾干備用。
操作步驟如下:
1、孕16d SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚,依次剪開(kāi)皮膚、肌肉、皮下筋膜,無(wú)菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks平衡鹽液中。
2、在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層,除去腦膜,剪碎組織成約1mm3大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min,中間搖晃一次。
3、隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。
4、用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM+10%FBS的離心管內(nèi),用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次,靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2~3次。
5、將所收集的上清經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾。
6、過(guò)濾后的細(xì)胞懸液于800r/min離心5min,棄上清,管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM+20%FBS)并吹打成單細(xì)胞懸液。
7、細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內(nèi),放入CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后換液并加入Ara-C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。
【注意以下幾點(diǎn)】
1、上面的步驟是傳統(tǒng)方法。有許多地方可以進(jìn)行改動(dòng):如消化時(shí)可以直接用0.125-0.25的胰酶消化15-20min左右,也可用DNA酶進(jìn)行消化,有人還直接進(jìn)行吹打,都可行。
2、上面雖然時(shí)大鼠皮層神經(jīng)元,但是同樣適用于小鼠,但是應(yīng)該選擇 孕13d 左右的小鼠。
3、神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞,因此在接種時(shí)細(xì)胞的密度一定要夠?。?/span>
4、在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時(shí),一定要注意玻片的來(lái)源和處理方法,這個(gè)非常重要,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響是很大的。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長(zhǎng)情況還不錯(cuò)的話(huà),那么您在以后的培養(yǎng)中最好還是用同一來(lái)源(廠(chǎng)家)的玻片。
5、如果有B27和neurobasal培養(yǎng)基,那么就方便了(不用加AraC)--
(1)把細(xì)胞懸液用(DMEM+20%FBS)懸浮,種到培養(yǎng)皿上6-12h后,全量換成2%B27的neurobasal培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),3d半量換液。
(2)把細(xì)胞懸液用直接用2%B27的neurobasal培養(yǎng)基懸浮接種。
(3)可以用新生1d內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。
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